Bakteriologisk vandanalyse - Bacteriological water analysis
Bakteriologisk vandanalyse er en metode til at analysere vand for at estimere antallet af tilstedeværende bakterier og om nødvendigt finde ud af, hvilken slags bakterier de er. Det repræsenterer et aspekt af vandkvaliteten . Det er en mikrobiologisk analytisk procedure, der bruger vandprøver og ud fra disse prøver bestemmer bakteriekoncentrationen. Det er derefter muligt at drage slutninger om vandets egnethed til anvendelse ud fra disse koncentrationer. Denne proces bruges for eksempel til rutinemæssigt at bekræfte, at vand er sikkert til konsum, eller at badevand og fritidsvand er sikkert at bruge.
Fortolkningen og handlingsudløserniveauet for forskellige farvande varierer afhængigt af brugen af vandet. Mens meget strenge niveauer gælder for drikkevand , gælder mere afslappede niveauer for marine badevand, hvor brugerne forventes at indtage meget lavere mængder vand.
Nærme sig
Det fælles træk ved alle disse rutinemæssige screeningprocedurer er, at den primære analyse er for indikatororganismer snarere end de patogener, der kan give anledning til bekymring. Indikatororganismer er bakterier såsom ikke-specifikke coliforme stoffer, Escherichia coli og Pseudomonas aeruginosa , der meget almindeligt findes i menneskets eller dyrets tarme, og som, hvis det opdages, kan antyde tilstedeværelsen af spildevand . Indikatororganismer bruges, fordi selv når en person er inficeret med en mere patogen bakterie, vil de stadig udskille mange millioner gange flere indikatororganismer end patogener. Det er derfor rimeligt at antage, at hvis indikatororganismens niveauer er lave, så vil patogenniveauer være meget lavere eller fraværende. Domme vedrørende vandets egnethed til anvendelse er baseret på meget omfattende præcedenser og vedrører sandsynligheden for, at enhver prøvepopulation af bakterier er i stand til at være infektiøs på et rimeligt statistisk niveau af tillid.
Analyse udføres normalt ved hjælp af kultur, biokemiske og undertiden optiske metoder. Når niveauer af indikatororganismer overstiger forudindstillede udløsere, kan der derefter foretages specifik analyse for patogener, og disse kan hurtigt detekteres (hvis det mistænkes) ved hjælp af specifikke kulturmetoder eller molekylærbiologi .
Metoder
De mest pålidelige metoder er direkte pladetællingsmetode og membranfiltreringsmetode. mEndo Agar anvendes i membranfiltreringen, mens VRBA Agar anvendes i metoden til direkte pladetælling. VRBA står for violet rød galdeagar. Et medium, der indeholder galdesalte, som fremmer væksten af gramnegativt og har hæmmende egenskaber til grampositivt, men ikke komplet hæmmende.
Disse medier indeholder lactose, som sædvanligvis fermenteres af lactosefermenterende bakterier, der producerer kolonier, der kan identificeres og karakteriseres. Lactosefermentering producerer farvede kolonier, mens ikke lactosefermentering producerer farveløse. Da analysen altid er baseret på en meget lille prøve taget fra et meget stort vandvolumen, er alle metoder afhængige af statistiske principper.
</ref>
Metode med flere rør
En af de ældste metoder kaldes metoden med flere rør. I denne metode fortyndes en målt underprøve (måske 10 ml) med 100 ml sterilt vækstmedium, og en portion på 10 ml dekanteres derefter i hvert af de ti rør. De resterende 10 ml fortyndes derefter igen, og processen gentages. Ved afslutningen af 5 fortyndinger producerer dette 50 rør, der dækker fortyndingsområdet fra 1:10 til 1: 10000.
Rørene inkuberes derefter ved en forudindstillet temperatur i et specificeret tidsrum, og i slutningen af processen tælles antallet af rør med vækst i for hver fortynding. Statistiske tabeller bruges derefter til at udlede koncentrationen af organismer i den oprindelige prøve. Denne metode kan forbedres ved hjælp af indikatormedium, der ændrer farve, når syredannende arter er til stede, og ved at inkludere et lille omvendt rør kaldet et Durham-rør i hvert prøverør. Det omvendte rør i Durham fanger al gas produceret. Produktionen af gas ved 37 grader Celsius er en stærk indikation af tilstedeværelsen af Escherichia coli .
ATP-test
En ATP-test er processen med hurtig måling af aktive mikroorganismer i vand gennem påvisning af adenosintrifosfat (ATP). ATP er et molekyle, der kun findes i og omkring levende celler, og som sådan giver det et direkte mål for biologisk koncentration og sundhed. ATP kvantificeres ved at måle det lys, der produceres gennem dets reaktion med det naturligt forekommende enzym firefly luciferase ved hjælp af et luminometer . Mængden af produceret lys er direkte proportional med mængden af biologisk energi til stede i prøven.
Anden generation ATP-test er specielt designet til vand, spildevand og industrielle applikationer, hvor prøver for det meste indeholder en række komponenter, der kan interferere med ATP-analysen.
Pladeantal
Pladetællingsmetoden er afhængig af bakterier, der dyrker en koloni på et næringsmedium, så kolonien bliver synlig med det blotte øje, og antallet af kolonier på en plade kan tælles. For at være effektiv skal fortyndingen af den originale prøve arrangeres, så der i gennemsnit dyrkes mellem 30 og 300 kolonier af målbakterien. Færre end 30 kolonier gør fortolkningen statistisk usund, mens mere end 300 kolonier ofte resulterer i overlappende kolonier og upræcision i optællingen. For at sikre, at der opnås et passende antal kolonier, dyrkes normalt flere fortyndinger. Denne tilgang anvendes i vid udstrækning til evaluering af effektiviteten af vandbehandling ved inaktivering af repræsentative mikrobielle forurenende stoffer, såsom E. coli efter ASTM D5465.
Laboratorieproceduren involverer at fremstille seriefortyndinger af prøven (1:10, 1: 100, 1: 1000 osv.) I sterilt vand og dyrke disse på næringsagar i en skål, der er forseglet og inkuberet. Typiske medier inkluderer pladetællingsagar for et generelt antal eller MacConkey-agar til at tælle gramnegative bakterier såsom E. coli . Typisk inkuberes et sæt plader ved 22 ° C og i 24 timer og et andet sæt ved 37 ° C i 24 timer. Sammensætningen af næringsstoffet inkluderer normalt reagenser, der modstår vækst af ikke-målorganismer og gør målorganismen let identificeret, ofte ved en farveændring i mediet. Nogle nylige metoder inkluderer et fluorescerende middel, så optælling af kolonierne kan automatiseres. I slutningen af inkubationsperioden tælles kolonierne med øjet, en procedure, der tager et par øjeblikke og ikke kræver et mikroskop, da kolonierne typisk er få millimeter tværs.
Membranfiltrering
De fleste moderne laboratorier bruger en forfining af det samlede antal plader, hvor seriefortyndinger af prøven vakuumfiltreres gennem specialfremstillede membranfiltre, og disse filtre lægges selv på næringsmedium i forseglede plader. Metoden ligner ellers konventionelle samlede pladetællinger. Membraner har et trykt millimeter gitter trykt på og kan pålideligt bruges til at tælle antallet af kolonier under et kikkertmikroskop.
Hæld plademetoden
Når analysen søger efter bakteriearter, der vokser dårligt i luft, foretages den indledende analyse ved at blande seriefortyndinger af prøven i flydende næringsagar, som derefter hældes i flasker, som derefter forsegles og lægges på deres sider for at frembringe en skrånende agar overflade. Kolonier, der udvikler sig i mediumets krop, kan tælles med øjet efter inkubation.
Det samlede antal kolonier kaldes det samlede levedygtige antal (TVC). Måleenheden er cfu / ml (eller kolonidannende enheder pr. Milliliter) og vedrører den originale prøve. Beregning af dette er et multiplum af det tællede antal kolonier ganget med den anvendte fortynding.
Patogenanalyse
Når prøver viser forhøjede niveauer af indikatorbakterier, foretages ofte yderligere analyse for at lede efter specifikke patogene bakterier. Arter, der almindeligvis undersøges i den tempererede zone, inkluderer Salmonella typhi og Salmonella Typhimurium . Afhængig af den sandsynlige kilde til forurening kan undersøgelser også omfatte organismer såsom Cryptosporidium spp . I tropiske områder foretages også rutinemæssig analyse af Vibrio cholerae .
Typer af næringsmedier anvendt i analysen
MacConkey-agar er dyrkningsmedium designet til at dyrke gramnegative bakterier og plette dem til lactosefermentering. Den indeholder galdesalte (til at hæmme de fleste gram-positive bakterier), krystalviolet farvestof (som også hæmmer visse gram-positive bakterier), neutralt rødt farvestof (som pletter mikrober, der fermenterer lactose), lactose og pepton . Alfred Theodore MacConkey udviklede det, mens han arbejdede som bakteriolog for Royal Commission on Spoile Disposal i Det Forenede Kongerige .
Endo agar indeholder pepton, lactose, dikaliumphosphat , agar, natriumsulfit, basisk fuchsin og blev oprindeligt udviklet til isolering af Salmonella typhi , men er nu almindeligt anvendt i vandanalyse. Som i MacConkey-agar gærer coliforme organismer lactosen, og kolonierne bliver røde. Ikke-laktosegærende organismer producerer klare, farveløse kolonier mod den svagt lyserøde baggrund af mediet.
mFC-medium anvendes til membranfiltrering og indeholder selektive og differentierende stoffer. Disse inkluderer rosolsyre til generelt at hæmme bakterievækst undtagen fækale coliformer, galdesalte hæmmer ikke-enteriske bakterier, og anilinblåt indikerer fækal coliformers evne til at fermentere lactose til syre, der forårsager en pH-ændring i mediet.
TYEA-medium indeholder trypton , gærekstrakt , almindeligt salt og L-arabinose pr. Liter glasdestilleret vand og er et ikke-selektivt medium, der normalt dyrkes ved to temperaturer (22 og 36 ° C) for at bestemme et generelt niveau af forurening (aka kolonitælling) .