Análisis bacteriológico de agua - Bacteriological water analysis
El análisis bacteriológico del agua es un método de análisis del agua para estimar el número de bacterias presentes y, si es necesario, para averiguar qué tipo de bacterias son. Representa un aspecto de la calidad del agua . Es un procedimiento analítico microbiológico que utiliza muestras de agua y a partir de estas muestras se determina la concentración de bacterias. Entonces es posible hacer inferencias sobre la idoneidad del agua para su uso a partir de estas concentraciones. Este proceso se utiliza, por ejemplo, para confirmar de forma rutinaria que el agua es segura para el consumo humano o que las aguas de baño y recreativas son seguras de usar.
La interpretación y los niveles de activación de la acción para diferentes aguas varían en función del uso que se haga del agua. Si bien se aplican niveles muy estrictos al agua potable , se aplican niveles más relajados a las aguas de baño marinas, donde se espera que los usuarios ingieran volúmenes mucho más bajos de agua.
Acercarse
La característica común de todos estos procedimientos de detección de rutina es que el análisis principal es para los organismos indicadores en lugar de los patógenos que podrían causar preocupación. Los organismos indicadores son bacterias como coliformes inespecíficos, Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa que se encuentran con mucha frecuencia en el intestino humano o animal y que, si se detectan, pueden sugerir la presencia de aguas residuales . Se utilizan organismos indicadores porque incluso cuando una persona está infectada con una bacteria más patógena, seguirá excretando millones de veces más organismos indicadores que patógenos. Por lo tanto, es razonable suponer que si los niveles de organismos indicadores son bajos, los niveles de patógenos serán mucho más bajos o estarán ausentes. Los juicios sobre la idoneidad del agua para su uso se basan en precedentes muy amplios y se relacionan con la probabilidad de que cualquier muestra de población de bacterias pueda ser infecciosa con un nivel de confianza estadístico razonable.
El análisis generalmente se realiza mediante métodos de cultivo, bioquímicos y, a veces, ópticos. Cuando los niveles de organismos indicadores superan los desencadenantes preestablecidos, se pueden realizar análisis específicos de patógenos y estos se pueden detectar rápidamente (cuando se sospeche) utilizando métodos de cultivo específicos o biología molecular .
Metodologias
Los métodos más fiables son el método de recuento directo en placa y el método de filtración por membrana. El agar mEndo se usa en la filtración por membrana, mientras que el agar VRBA se usa en el método de recuento directo en placa. VRBA significa agar biliar rojo violeta. Un medio que contiene sales biliares que promueve el crecimiento de gramnegativos y tiene características inhibidoras de gram positivas aunque no inhibidoras por completo.
Estos medios contienen lactosa que generalmente es fermentada por bacterias que fermentan la lactosa que producen colonias que pueden identificarse y caracterizarse. La fermentación de lactosa produce colonias coloreadas, mientras que la fermentación no lactosa produce colonias incoloras. Debido a que el análisis siempre se basa en una muestra muy pequeña tomada de un volumen muy grande de agua, todos los métodos se basan en principios estadísticos.
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Método de múltiples tubos
Uno de los métodos más antiguos se llama método de tubos múltiples. En este método, una submuestra medida (quizás 10 ml) se diluye con 100 ml de medio de cultivo estéril y luego se decanta una alícuota de 10 ml en cada uno de los diez tubos. Los 10 ml restantes se diluyen de nuevo y se repite el proceso. Al final de 5 diluciones, se obtienen 50 tubos que cubren el rango de dilución de 1:10 a 1: 10000.
Luego, los tubos se incuban a una temperatura preestablecida durante un tiempo específico y al final del proceso se cuenta el número de tubos con crecimiento para cada dilución. Luego, se utilizan tablas estadísticas para derivar la concentración de organismos en la muestra original. Este método se puede mejorar utilizando un medio indicador que cambia de color cuando hay especies formadoras de ácido e incluyendo un pequeño tubo invertido llamado tubo Durham en cada tubo de muestra. El tubo invertido de Durham atrapa cualquier gas producido. La producción de gas a 37 grados Celsius es un fuerte indicio de la presencia de Escherichia coli .
Prueba de ATP
Una prueba de ATP es el proceso de medir rápidamente los microorganismos activos en el agua mediante la detección de trifosfato de adenosina (ATP). El ATP es una molécula que se encuentra solo dentro y alrededor de las células vivas y, como tal, proporciona una medida directa de la concentración biológica y la salud. El ATP se cuantifica midiendo la luz producida a través de su reacción con la enzima luciferasa de luciérnaga de origen natural utilizando un luminómetro . La cantidad de luz producida es directamente proporcional a la cantidad de energía biológica presente en la muestra.
Las pruebas de ATP de segunda generación están diseñadas específicamente para agua, aguas residuales y aplicaciones industriales donde, en su mayor parte, las muestras contienen una variedad de componentes que pueden interferir con el análisis de ATP.
Recuento de placas
El método de recuento en placa se basa en bacterias que hacen crecer una colonia en un medio nutritivo para que la colonia se vuelva visible a simple vista y se pueda contar el número de colonias en un plato. Para que sea eficaz, la dilución de la muestra original debe disponerse de modo que crezcan en promedio entre 30 y 300 colonias de la bacteria diana. Menos de 30 colonias hace que la interpretación sea estadísticamente errónea, mientras que más de 300 colonias a menudo resulta en colonias superpuestas e imprecisión en el recuento. Para asegurar que se genere un número apropiado de colonias, normalmente se cultivan varias diluciones. Este enfoque se utiliza ampliamente para la evaluación de la eficacia del tratamiento del agua mediante la inactivación de contaminantes microbianos representativos como E. coli según ASTM D5465.
El procedimiento de laboratorio implica hacer diluciones seriadas de la muestra (1:10, 1: 100, 1: 1000, etc.) en agua estéril y cultivarlas en agar nutritivo en un plato que se sella e incuban. Los medios típicos incluyen agar de recuento en placa para un recuento general o agar MacConkey para contar bacterias gramnegativas como E. coli . Normalmente, un juego de placas se incuba a 22 ° C y durante 24 horas y un segundo juego a 37 ° C durante 24 horas. La composición del nutriente generalmente incluye reactivos que resisten el crecimiento de organismos no objetivo y hacen que el organismo objetivo sea fácilmente identificado, a menudo por un cambio de color en el medio. Algunos métodos recientes incluyen un agente fluorescente para que el recuento de colonias pueda automatizarse. Al final del período de incubación, las colonias se cuentan a ojo, un procedimiento que lleva unos minutos y no requiere un microscopio, ya que las colonias suelen tener unos pocos milímetros de diámetro.
Filtración de membrana
La mayoría de los laboratorios modernos utilizan un refinamiento del recuento total de placas en el que las diluciones en serie de la muestra se filtran al vacío a través de filtros de membrana especialmente diseñados y estos filtros se colocan en un medio nutritivo dentro de placas selladas. Por lo demás, la metodología es similar a los recuentos totales en placa convencionales. Las membranas tienen una cuadrícula milimétrica impresa y se pueden usar de manera confiable para contar el número de colonias bajo un microscopio binocular.
Método de plato de vertido
Cuando el análisis busca especies bacterianas que crecen poco en el aire, el análisis inicial se realiza mezclando diluciones seriadas de la muestra en agar nutritivo líquido que luego se vierte en botellas que luego se sellan y se colocan de lado para producir un agar inclinado. superficie. Las colonias que se desarrollan en el cuerpo del medio se pueden contar a ojo después de la incubación.
El número total de colonias se denomina recuento total viable (TVC). La unidad de medida es ufc / ml (o unidades formadoras de colonias por mililitro) y se relaciona con la muestra original. El cálculo de esto es un múltiplo del número contado de colonias multiplicado por la dilución utilizada.
Análisis de patógenos
Cuando las muestras muestran niveles elevados de bacterias indicadoras, a menudo se realizan análisis adicionales para buscar bacterias patógenas específicas. Las especies comúnmente investigadas en la zona templada incluyen Salmonella typhi y Salmonella Typhimurium . Dependiendo de la fuente probable de contaminación, la investigación también puede extenderse a organismos como Cryptosporidium spp . En las zonas tropicales, el análisis de Vibrio cholerae también se realiza de forma rutinaria.
Tipos de medios nutritivos utilizados en el análisis
El agar MacConkey es un medio de cultivo diseñado para cultivar bacterias gramnegativas y teñirlas para la fermentación de lactosa. Contiene sales biliares (para inhibir la mayoría de las bacterias grampositivas), colorante violeta cristal (que también inhibe ciertas bacterias grampositivas), colorante rojo neutro (que tiñe los microbios que fermentan la lactosa), lactosa y peptona . Alfred Theodore MacConkey lo desarrolló mientras trabajaba como bacteriólogo para la Royal Commission on Sewage Disposal en el Reino Unido .
El agar endo contiene peptona, lactosa, fosfato dipotásico , agar, sulfito de sodio, fucsina básica y se desarrolló originalmente para el aislamiento de Salmonella typhi , pero ahora se usa comúnmente en análisis de agua. Como en el agar MacConkey, los organismos coliformes fermentan la lactosa y las colonias se vuelven rojas. Los organismos que no fermentan la lactosa producen colonias claras e incoloras sobre el fondo rosado pálido del medio.
El medio mFC se utiliza en la filtración por membranas y contiene agentes selectivos y diferenciales. Estos incluyen el ácido rosólico para inhibir el crecimiento bacteriano en general, a excepción de los coliformes fecales, las sales biliares inhiben las bacterias no entéricas y el azul de anilina indica la capacidad de los coliformes fecales para fermentar la lactosa a ácido que provoca un cambio de pH en el medio.
El medio TYEA contiene triptona , extracto de levadura , sal común y L-arabinosa por litro de agua destilada en vidrio y es un medio no selectivo que generalmente se cultiva a dos temperaturas (22 y 36 ° C) para determinar un nivel general de contaminación (también conocido como recuento de colonias) .