Molekyylibiologia -Molecular biology

Wikipediasta, ilmaisesta tietosanakirjasta

Molekyylibiologia / m ə ˈ l ɛ k j ʊ l ər / on biologian haara, joka pyrkii ymmärtämään soluissa ja solujen välillä tapahtuvan biologisen aktiivisuuden molekyyliperustaa, mukaan lukien molekyylisynteesi, modifikaatio, mekanismit ja vuorovaikutukset. Biologisten makromolekyylien kemiallisen ja fysikaalisen rakenteen tutkimus tunnetaan molekyylibiologiana.

Molekyylibiologia kuvattiin alun perin lähestymistavana, joka keskittyi biologisten ilmiöiden perusteisiin - paljastamaan biologisten molekyylien rakenteet sekä niiden vuorovaikutukset ja kuinka nämä vuorovaikutukset selittävät klassisen biologian havaintoja.

Vuonna 1945 termiä molekyylibiologia käytti fyysikko William Astbury. Kehitys molekyylibiologian alalla tapahtui hyvin myöhään, jotta ymmärrettiin, että monimutkainen järjestelmä tai edullinen lähestymistapa tehtäisiin yksinkertaisella tavalla käyttämällä bakteereja ja bakteriofaageja, tämä organismi antaa tietoa biologisista perusprosesseista helpommin kuin eläinsolu. Vuonna 1953 kaksi nuorta miestä nimeltä Francis Crick ja James Watson, jotka työskentelivät Medical Research Councilin yksikössä, Cavendishin laboratoriossa, Cambridgessa (nykyinen MRC Laboratory of Molecular Biology ) tekivät DNA:n kaksoiskierteisen mallin, joka muutti koko tutkimusskenaarion, ja he ehdottivat DNA:ta. rakenne perustuu Rosalind Franklinin ja Maurice Wilkinsin aikaisempiin tutkimuksiin, sitten tutkimus johti DNA-materiaalin löytämiseen muista mikro-organismeista, kasveista ja eläimistä.

Molekyylibiologia ei ole pelkästään biologisten molekyylien ja niiden vuorovaikutusten tutkimusta; pikemminkin se on myös kokoelma tekniikoita, jotka on kehitetty alan synnystä lähtien ja jotka ovat antaneet tutkijoille mahdollisuuden oppia molekyyliprosesseista. Yksi merkittävä alan mullistanut tekniikka on polymeraasiketjureaktio (PCR), joka kehitettiin vuonna 1983. PCR on reaktio, joka monistaa pieniä määriä DNA:ta, ja sitä käytetään monissa sovelluksissa eri tieteenaloilla, kuten myöhemmin käsitellään. .

Molekyylibiologian keskeinen dogma kuvaa prosessia, jossa DNA transkriptoidaan RNA:ksi, joka sitten muunnetaan proteiiniksi.

Molekyylibiologialla on myös ratkaiseva rooli yksittäisten solujen rakenteiden, toimintojen ja sisäisten kontrollien ymmärtämisessä, joita kaikkia voidaan käyttää uusien lääkkeiden tehokkaaseen kohdistamiseen, sairauksien diagnosointiin ja solufysiologian ymmärtämiseen. Osa kliinisistä tutkimuksista ja molekyylibiologiasta syntyvistä lääkehoidoista kuuluu geeniterapiaan, kun taas molekyylibiologian tai molekyylisolubiologian käyttöä lääketieteessä kutsutaan nykyään molekyylilääketieteeksi .

Molekyylibiologian historia

Molekyylibiologia on biokemian ja genetiikan leikkauskohdassa; kun nämä tieteenalat syntyivät ja kehittyivät 1900-luvulla, kävi selväksi, että ne molemmat pyrkivät määrittämään solujen elintärkeiden toimintojen taustalla olevat molekyylimekanismit. Molekyylibiologian edistyminen on liittynyt läheisesti uusien teknologioiden kehittämiseen ja niiden optimointiin. Molekyylibiologia on selvitetty monien tutkijoiden työllä, joten alan historia riippuu näiden tutkijoiden ja heidän kokeidensa ymmärtämisestä.

Kaikki alkaa bakteerien transformaatioilmiöstä, Frederick Griffith havaitsi vuonna 1928 transformaatioilmiön yhdestä bakteerista toiseen [tunnetaan nyt nimellä geneettinen transformaatio]. Tuolloin hän ei osannut selittää transformaatioilmiötä. Myöhemmin vuonna 1944 kolme tiedemiestä Oswald Avery, Colin Macleod ja Maclyn McCarty osoittivat koko bakteerien transformaatioilmiön. Kahden vuoden kuluttua vuonna 1930 molekyylibiologia perustettiin viralliseksi tieteenalaksi. Mutta termi "Molecular Biology" keksittiin vasta vuonna 1938, ja sen teki tiedemies Warren Weaver, joka työskenteli Rockefeller Foundationin luonnontieteiden johtajana.

Seuraavasta kokeesta pääteltiin, että DNA on geneettinen perusmateriaali, joka aiheutti geneettiset muutokset. DNA:n peruskoostumus tiedettiin, että se sisältää neljä emästä, jotka tunnetaan nimellä - adeniini, guaniini, tymiini ja sytosiini. Joten kemiallisen koostumuksen ja Maurice Wilkinsin ja Rosalind Franklinin tekemän röntgenkristallografian perusteella DNA-rakennetta ehdottivat James Watson ja Francis Crick. Mutta ennen kuin Watson ja Crick ehdottivat DNA-rakennetta, itävaltalaissyntyinen tiedemies Erwin Chargaff ehdotti vuonna 1950 teoriaa/sääntöä [tunnetaan nykyään Chargaffin sääntönä], jonka mukaan adeniinin ja tymiinin sekä guaniinin ja sytosiinin määrät ovat yhtä suuria. suhteessa.

Chargaffin sääntö

"Chargaffin sääntö totesi, että minkä tahansa organismilajin DNA:ssa tulisi olla puriinin ja pyrimidiinien stökiömetrinen suhde 1:1 (eli A+G=T+C) ja tarkemmin sanottuna, että guaniinin määrän tulee olla yhtä suuri kuin sytosiini ja adeniinin määrän tulee olla yhtä suuri kuin tymiini . Tämä kuvio löytyy molemmista DNA-juosteista".

Genetiikan ala syntyi yrityksenä ymmärtää geneettisen periytymisen molekyylimekanismeja ja geenin rakennetta . Gregor Mendel aloitti tämän työn vuonna 1866, kun hän kirjoitti ensimmäisen kerran geneettisen periytymisen lait perustuen tutkimuksiinsa hernekasvien paritteluristeyksistä. Yksi tällainen geneettisen periytymisen laki on erottelulaki, jonka mukaan diploidit yksilöt, joilla on kaksi alleelia tietylle geenille, välittävät yhden näistä alleeleista jälkeläisilleen. Hänen kriittisen työnsä vuoksi geneettisen perinnön tutkimusta kutsutaan yleisesti Mendelin genetiikkaksi .

Merkittävä virstanpylväs molekyylibiologiassa oli DNA:n rakenteen löytäminen. Tämän työn aloitti vuonna 1869 Friedrich Miescher , sveitsiläinen biokemisti, joka ehdotti ensimmäisenä nukleiiniksi kutsuttua rakennetta, jonka tiedämme nyt olevan deoksiribonukleiinihappo tai DNA. Hän löysi tämän ainutlaatuisen aineen tutkimalla mätätäytteisten siteiden komponentteja ja panemalla merkille "fosforipitoisten aineiden" ainutlaatuiset ominaisuudet. Toinen merkittävä DNA-mallin tekijä oli Phoebus Levene, joka ehdotti DNA:n "polynukleotidimallia" vuonna 1919 biokemiallisten hiivakokeidensa tuloksena. Vuonna 1950 Erwin Chargaff laajensi Levenen työtä ja selvitti muutamia nukleiinihappojen kriittisiä ominaisuuksia: ensinnäkin nukleiinihappojen sekvenssi vaihtelee lajien välillä. Toiseksi puriinien (adeniini ja guaniini) kokonaispitoisuus on aina yhtä suuri kuin pyrimidiinien (kysteiini ja tymiini) kokonaispitoisuus. Tämä tunnetaan nykyään Chargaffin sääntönä. Vuonna 1953 James Watson ja Francis Crick julkaisivat DNA:n kaksoiskierteisen rakenteen käyttämällä Rosalind Franklinin ja Maurice Wilkinsin röntgenkristallografiatyötä . Watson ja Crick kuvasivat DNA:n rakennetta ja arvelivat tämän ainutlaatuisen rakenteen vaikutuksista mahdollisiin DNA:n replikaation mekanismeihin.

JD Watson ja FHC Crick saivat Nobel-palkinnon vuonna 1962 yhdessä Maurice Wilkensin kanssa DNA-rakenteen mallin ehdottamisesta.

Ajan myötä KA Marcer ja Frederick Sanger löysivät vuonna 1964 E. colista omituisen amioasyyli-tRNA:n, nimeltään N-formyylimetionyyli – tRNA, ja selittivät, että tällä molekyylillä on rooli ketjun pidentymisen erityisessä mekanismissa. Hänelle myönnettiin toinen Nobel-palkinto F´174 bakteriofagin yksijuosteisen DNA:n 5 400 nukleotidin täydellisen sekvenssin löytämisestä.

Vuonna 1961 osoitettiin, että kun geeni koodaa proteiinia, geenin DNA :n kolme peräkkäistä emästä määrittelee proteiinin jokaisen peräkkäisen aminohapon. Siten geneettinen koodi on triplettikoodi, jossa jokainen tripletti (kutsutaan kodoniksi) määrittelee tietyn aminohapon. Lisäksi osoitettiin, että kodonit eivät mene päällekkäin toistensa kanssa proteiinia koodaavassa DNA-sekvenssissä ja että jokainen sekvenssi luetaan kiinteästä aloituspisteestä.

Vuosina 1962–1964 bakteeriviruksen ehdollisesti tappavia mutantteja käyttämällä saavutettiin perustavaa laatua olevaa edistystä ymmärtämisessämme DNA: n replikaatio-, DNA-korjaus-, DNA-rekombinaatio- ja kokoonpanokoneistoissa käytettävien proteiinien toiminnoista ja vuorovaikutuksista. molekyylirakenteista.

Watsonin ja Crickin DNA-rakenteen kaavamainen esitys
Kulman kuvaus DNA:n rakenteessa

F. Griffithin kokeilu

Kokeen kaavamainen esitys

Vuonna 1928 Fredrick Griffith kohtasi pneumokokkibakteerien virulenssiominaisuuden, joka tappoi laboratoriorottia. Mendelin mukaan tuolloin vallitseva geeninsiirto saattoi tapahtua vain vanhemmilta tytärsoluille. Griffith kehitti toisen teorian, jonka mukaan saman sukupolven jäsenessä tapahtuva geeninsiirto tunnetaan horisontaalisena geeninsiirrona (HGT). Tätä ilmiötä kutsutaan nykyään geneettiseksi transformaatioksi.

Griffith käsitteli Streptococcus pneumoniae -bakteereja, joilla oli kaksi erilaista kantaa, yksi virulentti ja sileä ja yksi avirulentti ja karkea. Sileä kannan ulkonäkö oli kimaltelevaa, koska siinä oli tietyntyyppistä polysakkaridia – glukoosin ja glukuronihapon polymeeriä. Tämän bakteerien polysakkaridikerroksen vuoksi isännän immuunijärjestelmä ei pysty tunnistamaan bakteereja ja se tappaa isännän. Toisesta, avirulentista, karkeasta kannasta puuttuu tämä polysakkaridikapseli, ja se on tylsä, karkea ulkonäkö.

Kapselin läsnäolon tai puuttumisen kannassa tiedetään olevan geneettisesti määritettyä. Sileitä ja karkeita venymiä esiintyy useissa eri tyypeissä, kuten SI, S-II, S-III jne. ja RI, R-II, R-III jne. vastaavasti. Kaikki nämä S- ja R-bakteerien alatyypit eroavat toisistaan ​​niiden tuottaman antigeenityypin suhteen.

Hersheyn ja Chasen kokeilu

Hersheyn ja Chasen kokeilu

Hersheyn ja Chasen kokeesta saatiin vahvistus siitä, että DNA on geneettinen materiaali, joka on infektion aiheuttaja. He käyttivät kokeeseen E. colia ja bakteriofagia. Tämä kokeilu tunnetaan myös tehosekoitinkokeena, koska keittiön tehosekoitinta käytettiin päälaitteena. Alfred Hershey ja Martha Chase osoittivat, että faagipartikkelin bakteeriin ruiskuttama DNA sisältää kaikki tiedot, joita tarvitaan jälkeläisten faagipartikkelien syntetisoimiseen. He käyttivät radioaktiivisuutta leimaamaan bakteriofagin proteiinikuoren radioaktiivisella rikillä ja DNA:n radioaktiivisella fosforilla kahteen eri koeputkeen. Bakteriofagin ja E. colin sekoittamisen jälkeen koeputkeen alkaa inkubaatiojakso, jossa faagi muuttaa geneettistä materiaalia E. coli -soluissa. Sitten seosta sekoitetaan tai sekoitetaan, mikä erottaa faagin E. coli -soluista. Koko seos sentrifugoidaan ja pelletti, joka sisältää E. coli -soluja, tarkistettiin ja supernatantti heitettiin pois. E. coli -soluissa oli radioaktiivista fosforia, mikä osoitti, että transformoitu materiaali oli DNA:ta, ei proteiinikuorta.

Transformoitunut DNA kiinnittyy E. colin DNA:han ja radioaktiivisuutta nähdään vain bakteriofagin DNA:ssa. Tämä mutatoitunut DNA voidaan siirtää seuraavalle sukupolvelle ja transduktioteoria syntyi. Transduktio on prosessi, jossa bakteeri-DNA kuljettaa bakteriofagien fragmentin ja välittää sen seuraavalle sukupolvelle. Tämä on myös eräänlainen horisontaalinen geeninsiirto.

Moderni molekyylibiologia

Kun lähestymme 20-luvun puoliväliä, molekyylibiologia on siirtymässä kulta-aikaan, jonka määrittelee sekä vertikaalinen että horisontaalinen tekninen kehitys. Vertikaalisesti uudet teknologiat mahdollistavat biologisten prosessien reaaliaikaisen seurannan atomitasolla. Molekyylibiologit voivat nykyään saada yhä edullisempia sekvensointitietoja yhä korkeammissa syvyyksissä, mikä helpottaa uusien geneettisten manipulointimenetelmien kehittämistä uusissa ei-malliorganismeissa. Samoin synteettiset molekyylibiologit ohjaavat pienten ja makromolekyylien teollista tuotantoa ottamalla käyttöön eksogeenisiä aineenvaihduntareittejä erilaisissa prokaryoottisissa ja eukaryoottisissa solulinjoissa.

Horisontaalisesti datan sekvensointi on tulossa edullisemmaksi ja sitä hyödynnetään monilla eri tieteenaloilla. Tämä edistää teollisuuden kehitystä kehitysmaissa ja lisää yksittäisten tutkijoiden saavutettavuutta. Samoin yksilöt voivat nyt suunnitella ja toteuttaa CRISPR-Cas9-geeninmuokkauskokeita alle 10 000 dollarilla uusissa organismeissa, mikä edistää teollisten ja lääketieteellisten sovellusten kehitystä.

Suhde muihin biologian tieteisiin

Kaavamainen suhde biokemian, genetiikan ja molekyylibiologian välillä

Seuraavassa luettelossa kuvataan näkemystä molekyylibiologian ja muiden siihen liittyvien alojen välisistä tieteidenvälisistä suhteista.

Vaikka tutkijat harjoittavat molekyylibiologialle ominaisia ​​tekniikoita, on yleistä yhdistää niitä genetiikan ja biokemian menetelmiin . Suuri osa molekyylibiologiasta on kvantitatiivista, ja viime aikoina on tehty huomattava määrä työtä tietojenkäsittelytekniikan, kuten bioinformatiikan ja laskennallisen biologian, avulla . Molekyyligenetiikka, geenien rakenteen ja toiminnan tutkimus, on ollut molekyylibiologian merkittävimpiä ala-aloja 2000-luvun alusta lähtien. Muut biologian osa-alueet saavat tietoa molekyylibiologiasta joko suoraan tutkimalla molekyylien vuorovaikutuksia sellaisenaan, kuten solubiologiassa ja kehitysbiologiassa, tai epäsuorasti, kun molekyylitekniikoita käytetään päättelemään populaatioiden tai lajien historiallisia ominaisuuksia, kuten evoluutiobiologian aloilla, kuten populaatiogenetiikka ja fylogenetiikka . Biofysiikassa on myös pitkä perinne tutkia biomolekyylejä "alusta ylöspäin" tai molekyylisesti .

Molekyylibiologian tekniikat

DNA-animaatio

Molekyylikloonaus

Transduktiokuva

Molekyylikloonausta käytetään kiinnostavan DNA-sekvenssin eristämiseen ja siirtämiseen plasmidivektoriin. Tämä yhdistelmä-DNA-tekniikka kehitettiin ensimmäisen kerran 1960-luvulla. Tässä tekniikassa kiinnostavaa proteiinia koodaava DNA - sekvenssi kloonataan käyttämällä polymeraasiketjureaktiota (PCR) ja/tai restriktioentsyymejä plasmidiin ( ekspressiovektori ). Plasmidivektorilla on yleensä vähintään 3 erottuvaa ominaisuutta: replikaation aloituskohta, monikloonauskohta (MCS) ja selektiivinen markkeri (yleensä antibioottiresistenssi ). Lisäksi ylävirtaan MCS:stä ovat promoottorialueet ja transkription aloituskohta, jotka säätelevät kloonatun geenin ilmentymistä.

Tämä plasmidi voidaan liittää joko bakteeri- tai eläinsoluihin. DNA:n vieminen bakteerisoluihin voidaan tehdä transformoimalla paljaan DNA:n oton kautta, konjugoimalla solu-solukontaktin kautta tai transduktiolla virusvektorin kautta. DNA:n viemistä eukaryoottisoluihin, kuten eläinsoluihin, fysikaalisin tai kemiallisin keinoin kutsutaan transfektioksi . Saatavilla on useita erilaisia ​​transfektiotekniikoita, kuten kalsiumfosfaattitransfektio, elektroporaatio, mikroinjektio ja liposomitransfektio . Plasmidi voidaan integroida genomiin, mikä johtaa stabiiliin transfektioon, tai se voi pysyä genomista riippumattomana ja ilmentyä tilapäisesti, jota kutsutaan ohimeneväksi transfektioksi.

Kiinnostuksen kohteena olevaa proteiinia koodaava DNA on nyt solun sisällä, ja proteiinia voidaan nyt ilmentää. Erilaisia ​​järjestelmiä, kuten indusoituvia promoottoreita ja spesifisiä solusignalointitekijöitä, on saatavilla auttamaan mielenkiinnon kohteena olevan proteiinin ilmentymistä korkeilla tasoilla. Suuria määriä proteiinia voidaan sitten uuttaa bakteeri- tai eukaryoottisolusta. Proteiinin entsymaattista aktiivisuutta voidaan testata erilaisissa tilanteissa, proteiini voidaan kiteyttää niin, että sen tertiääristä rakennetta voidaan tutkia, tai lääketeollisuudessa voidaan tutkia uusien lääkkeiden aktiivisuutta proteiinia vastaan.

Polymeraasiketjureaktio

Polymeraasiketjureaktio (PCR) on erittäin monipuolinen tekniikka DNA:n kopioimiseen. Lyhyesti sanottuna PCR mahdollistaa tietyn DNA-sekvenssin kopioimisen tai muuntamisen ennalta määrätyillä tavoilla. Reaktio on erittäin voimakas ja täydellisissä olosuhteissa voisi monistaa yhden DNA-molekyylin 1,07 miljardiksi molekyyliksi alle kahdessa tunnissa. PCR:llä on monia sovelluksia, mukaan lukien geeniekspression tutkimus, patogeenisten mikro-organismien havaitseminen, geneettisten mutaatioiden havaitseminen ja mutaatioiden tuominen DNA:han. PCR-tekniikkaa voidaan käyttää restriktioentsyymikohtien viemiseen DNA-molekyylien päihin tai DNA:n tiettyjen emästen mutatoimiseen, jälkimmäistä menetelmää kutsutaan kohdennetuksi mutageneesiksi . PCR:tä voidaan käyttää myös sen määrittämiseen, löytyykö tietty DNA-fragmentti cDNA-kirjastosta . PCR:llä on monia muunnelmia, kuten käänteistranskriptio-PCR ( RT-PCR ) RNA:n monistamiseksi ja viime aikoina kvantitatiivinen PCR, joka mahdollistaa DNA- tai RNA-molekyylien kvantitatiivisen mittaamisen.

Kahden prosentin agaroosigeeli boraattipuskurissa valettu geelialustalle .

Geelielektroforeesi

SDS-SIVU

Geelielektroforeesi on tekniikka, jossa molekyylit erotetaan niiden koon mukaan käyttämällä agaroosi- tai polyakryyliamidigeeliä. Tämä tekniikka on yksi molekyylibiologian tärkeimmistä työkaluista. Perusperiaate on, että DNA-fragmentit voidaan erottaa kohdistamalla sähkövirta geelin poikki - koska DNA-runko sisältää negatiivisesti varautuneita fosfaattiryhmiä, DNA kulkeutuu agaroosigeelin läpi kohti virran positiivista päätä. Proteiinit voidaan erottaa myös koon perusteella SDS-PAGE- geelillä tai koon ja sähkövarauksen perusteella käyttämällä niin sanottua 2D-geelielektroforeesia .

Proteiinit värjätty PAGE-geelillä käyttäen Coomassie blue -väriä.

Bradfordin määritys

Bradford Assay on molekyylibiologian tekniikka, joka mahdollistaa proteiinimolekyylien nopean ja tarkan kvantifioinnin käyttämällä Coomassie Brilliant Blue G-250 -nimisen väriaineen ainutlaatuisia ominaisuuksia. Coomassie Blue käy läpi näkyvän värimuutoksen punaruskeasta kirkkaan siniseksi sitoutuessaan proteiiniin. Epävakaassa, kationisessa tilassaan Coomassie Bluen taustaaallonpituus on 465 nm ja se antaa punaruskean värin. Kun Coomassie Blue sitoutuu proteiiniin happamassa liuoksessa, taustan aallonpituus siirtyy 595 nm:iin ja väriaine antaa kirkkaan sinisen värin. Määrityksen proteiinit sitovat Coomassie-sinistä noin 2 minuutissa, ja proteiini-värikompleksi on stabiili noin tunnin ajan, vaikka on suositeltavaa ottaa absorbanssilukemat 5-20 minuutin kuluessa reaktion alkamisesta. Proteiinikonsentraatio Bradford-määrityksessä voidaan sitten mitata käyttämällä näkyvän valon spektrofotometriä, joten se ei vaadi laajaa laitteistoa.

Tämän menetelmän kehitti vuonna 1975 Marion M. Bradford, ja se on mahdollistanut huomattavasti nopeamman ja tarkemman proteiinien kvantifioinnin verrattuna aikaisempiin menetelmiin: Lowryn menetelmään ja biureettimääritykseen. Toisin kuin aikaisemmissa menetelmissä, Bradford-määritys ei ole herkkä useiden ei-proteiinimolekyylien, mukaan lukien etanolin, natriumkloridin ja magnesiumkloridin, aiheuttamille häiriöille. Se on kuitenkin herkkä voimakkaiden alkalisten puskurointiaineiden, kuten natriumdodekyylisulfaatin (SDS) vaikutuksille.

Makromolekyylien blottaus ja koetus

Termit northern, western ja eastern blotting ovat peräisin alun perin molekyylibiologian vitsistä, jota käytettiin termillä Southern blotting Edwin Southernin kuvaaman tekniikan mukaisesti blotted DNA:n hybridisaatioon. Patricia Thomas, RNA-blotin kehittäjä, joka sitten tuli tunnetuksi nimellä Northern blot, ei itse asiassa käyttänyt termiä.

Southern blotting

Keksijänsä, biologi Edwin Southernin mukaan nimetty Southern blot on menetelmä, jolla tutkitaan tietyn DNA-sekvenssin läsnäolo DNA-näytteessä. DNA-näytteet ennen tai jälkeen restriktioentsyymi (restriktioendonukleaasi) -digestiota erotetaan geelielektroforeesilla ja siirretään sitten kalvolle blottauksella kapillaaritoiminnan kautta . Kalvo altistetaan sitten leimatulle DNA-koettimelle, jolla on komplementin emässekvenssi kiinnostavan DNA:n sekvenssin kanssa. Southern-blottausta käytetään harvemmin laboratoriotieteissä, koska muut tekniikat, kuten PCR, pystyvät havaitsemaan spesifisiä DNA-sekvenssejä DNA-näytteistä. Näitä blotteja käytetään kuitenkin edelleen joissakin sovelluksissa, kuten siirtogeenin kopioluvun mittaamisessa siirtogeenisissä hiirissä tai geenipoistogeenisten alkion kantasolulinjojen suunnittelussa .

Northern blottaus

Northern blot -kaavio

Northern blottia käytetään spesifisten RNA-molekyylien läsnäolon tutkimiseen suhteellisena vertailuna eri RNA-näytteiden sarjan välillä. Se on pohjimmiltaan denaturoivan RNA-geelielektroforeesin ja blotin yhdistelmä . Tässä prosessissa RNA erotetaan koon perusteella ja siirretään sitten kalvolle, joka sitten tutkitaan kiinnostavan sekvenssin leimatulla komplementilla . Tulokset voidaan visualisoida useilla eri tavoilla riippuen käytetystä etiketistä; useimmat johtavat kuitenkin vyöhykkeiden paljastamiseen, jotka edustavat näytteessä havaitun RNA:n kokoa. Näiden vyöhykkeiden intensiteetti on suhteessa kohde-RNA:n määrään analysoiduissa näytteissä. Menettelyä käytetään yleisesti tutkimaan, milloin ja kuinka paljon geenin ilmentymistä tapahtuu mittaamalla kuinka paljon kyseistä RNA:ta on eri näytteissä, olettaen, että transkription jälkeistä säätelyä ei tapahdu ja että mRNA:n tasot heijastavat vastaavan proteiinin suhteellisia tasoja. tuotettu. Se on yksi perustyökaluista määrittää, mihin aikaan ja missä olosuhteissa tietyt geenit ilmentyvät elävissä kudoksissa.

Western blottaus

Western blot on tekniikka, jolla spesifiset proteiinit voidaan havaita proteiinien seoksesta. Western blot -testejä voidaan käyttää eristettyjen proteiinien koon määrittämiseen sekä niiden ilmentymisen kvantifiointiin. Western blot -menetelmässä proteiinit erotetaan ensin koon mukaan ohuessa geelissä, joka on kerrostettu kahden lasilevyn välissä SDS-PAGE- tekniikalla . Geelissä olevat proteiinit siirretään sitten polyvinylideenifluoridille (PVDF), nitroselluloosalle, nailonille tai muulle tukikalvolle. Tämä kalvo voidaan sitten tutkia vasta -aineliuoksilla . Vasta-aineet, jotka sitoutuvat spesifisesti kiinnostavaan proteiiniin, voidaan sitten visualisoida useilla eri tekniikoilla, mukaan lukien värilliset tuotteet, kemiluminesenssi tai autoradiografia . Usein vasta-aineet on leimattu entsyymeillä. Kun kemiluminesoiva substraatti altistetaan entsyymille, se mahdollistaa havaitsemisen. Western blot -tekniikoiden käyttö mahdollistaa havaitsemisen lisäksi myös kvantitatiivisen analyysin. Western blottauksen kanssa analogisia menetelmiä voidaan käyttää värjäämään suoraan spesifisiä proteiineja elävissä soluissa tai kudosleikkeissä .

Eastern blotting

Easter blotting -tekniikkaa käytetään proteiinien translaation jälkeisten modifikaatioiden havaitsemiseen. PVDF- tai nitroselluloosakalvolle blotatut proteiinit tutkitaan modifikaatioiden varalta käyttämällä erityisiä substraatteja.

Mikrosirut

DNA-mikrosiru tulostetaan
Kohteen hybridisaatio koettimeen

DNA - mikrosiru on kokoelma täpliä, jotka on kiinnitetty kiinteään alustaan, kuten mikroskoopin objektilasiin, jossa jokainen täplä sisältää yhden tai useamman yksijuosteisen DNA- oligonukleotidifragmentin . Matriisit mahdollistavat suurten määrien hyvin pienten (halkaisijaltaan 100 mikrometrin) täplien sijoittamisen yhdelle levylle. Jokaisella paikalla on DNA-fragmenttimolekyyli, joka on komplementaarinen yksittäisen DNA-sekvenssin kanssa . Tämän tekniikan muunnelma mahdollistaa tietyssä kehitysvaiheessa olevan organismin geenin ilmentymisen määrittämisen ( ekspressioprofilointi ). Tässä tekniikassa kudoksessa oleva RNA eristetään ja muunnetaan leimatuksi komplementaariseksi DNA: ksi (cDNA). Tämä cDNA hybridisoidaan sitten sirussa oleviin fragmentteihin ja hybridisaation visualisointi voidaan tehdä. Koska useita ryhmiä voidaan tehdä täsmälleen samalla fragmenttien sijainnilla, ne ovat erityisen hyödyllisiä vertailtaessa kahden eri kudoksen, kuten terveen ja syöpäkudoksen, geeniekspressiota. Voidaan myös mitata, mitkä geenit ilmentyvät ja kuinka ekspressio muuttuu ajan tai muiden tekijöiden myötä. On olemassa monia erilaisia ​​tapoja valmistaa mikrosiruja; yleisimpiä ovat piisirut, mikroskoopin objektilasit, joissa on halkaisijaltaan ~100 mikrometrin täpliä, mukautettuja ryhmiä ja ryhmiä, joissa on suurempia pisteitä huokoisilla kalvoilla (makroarrays). Tietyssä taulukossa voi olla missä tahansa 100 pisteestä yli 10 000:een. Tauluja voidaan tehdä myös muista molekyyleistä kuin DNA:sta.

Alleelispesifinen oligonukleotidi

Alleelispesifinen oligonukleotidi (ASO) on tekniikka, joka mahdollistaa yksittäisten emästen mutaatioiden havaitsemisen ilman PCR- tai geelielektroforeesia. Lyhyet (20–25 nukleotidin pituiset), leimatut koettimet altistetaan fragmentoimattomalle kohde-DNA:lle, hybridisaatio tapahtuu erittäin spesifisesti koettimien lyhyen pituuden vuoksi ja jopa yksi emäsmuutos estää hybridisaatiota. Sitten kohde-DNA pestään ja leimatut koettimet, jotka eivät hybridisoituneet, poistetaan. Sitten kohde-DNA analysoidaan koettimen läsnäolon suhteen radioaktiivisuuden tai fluoresenssin avulla. Tässä kokeessa, kuten useimmissa molekyylibiologian tekniikoissa, on käytettävä kontrollia onnistuneen kokeen varmistamiseksi.

Molekyylibiologiassa menetelmiä ja teknologioita kehitetään jatkuvasti ja vanhoista teknologioista luovutaan. Esimerkiksi ennen DNA- geelielektroforeesin ( agaroosi tai polyakryyliamidi ) tuloa DNA-molekyylien koko määritettiin tyypillisesti nopeussedimentaatiolla sakkaroosigradienteissa, hidas ja työvoimavaltainen tekniikka, joka vaatii kalliita instrumentteja; ennen sakkaroosigradientteja käytettiin viskometriaa . Historiallisen kiinnostuksensa lisäksi kannattaa usein tietää vanhemmasta tekniikasta, sillä silloin tällöin on hyödyllistä ratkaista jokin uusi ongelma, johon uudempi tekniikka ei sovellu.

Katso myös

Viitteet

Lue lisää

Ulkoiset linkit