Molekuláris biológia -Molecular biology

A Wikipédiából, a szabad enciklopédiából

A molekuláris biológia / m ə ˈ l ɛ k j ʊ l ər / a biológia azon ága, amely igyekszik megérteni a sejteken belüli és sejtközi biológiai aktivitás molekuláris alapjait, beleértve a molekuláris szintézist, módosításokat, mechanizmusokat és kölcsönhatásokat. A biológiai makromolekulák kémiai és fizikai szerkezetének tanulmányozása molekuláris biológia néven ismert.

A molekuláris biológiát először a biológiai jelenségek hátterére összpontosító megközelítésként írták le – feltárva a biológiai molekulák szerkezetét, valamint kölcsönhatásaikat, és azt, hogy ezek a kölcsönhatások hogyan magyarázzák a klasszikus biológia megfigyeléseit.

1945-ben William Astbury fizikus használta a molekuláris biológia kifejezést. A fejlődés a molekuláris biológia területén nagyon későn történt, hogy megértsék, hogy a komplex rendszer vagy előnyös megközelítés egyszerű megértési módban valósulhat meg baktériumok és bakteriofágok felhasználásával, ez az organizmus könnyebben ad információt az alapvető biológiai folyamatokról, mint az állati sejt. 1953-ban két fiatal férfi, Francis Crick és James Watson, akik az Orvosi Kutatási Tanács egységében, a cavendish-i laboratóriumban (ma MRC Molekuláris Biológiai Laboratórium ) dolgoztak, elkészítették a DNS kettős hélix modelljét, amely megváltoztatta az egész kutatási forgatókönyvet, és javasolták a DNS-t. Rosalind Franklin és Maurice Wilkins korábbi kutatásain alapuló szerkezet, majd a kutatás más mikroorganizmusokban, növényekben és állatokban DNS-anyag megtalálásához vezetett.

A molekuláris biológia nem egyszerűen a biológiai molekulák és kölcsönhatásaik tanulmányozása; hanem a terület keletkezése óta kifejlesztett technikák gyűjteménye, amelyek lehetővé tették a tudósok számára, hogy megismerjék a molekuláris folyamatokat. Az egyik figyelemre méltó technika, amely forradalmasította a területet, a polimeráz láncreakció (PCR), amelyet 1983-ban fejlesztettek ki. A PCR egy olyan reakció, amely kis mennyiségű DNS-t amplifikál, és számos tudományterületen alkalmazzák, amint arról később lesz szó. .

A molekuláris biológia központi dogmája azt a folyamatot írja le, amelyben a DNS RNS-vé íródik át, amely aztán fehérjévé alakul.

A molekuláris biológia kritikus szerepet játszik az egyes sejteken belüli szerkezetek, funkciók és belső kontrollok megértésében is, amelyek mindegyike felhasználható új gyógyszerek hatékony célba juttatására, betegségek diagnosztizálására és a sejtfiziológia jobb megértésére. A molekuláris biológiából származó klinikai kutatások és gyógyászati ​​terápiák egy része a génterápia hatálya alá tartozik, míg a molekuláris biológia vagy a molekuláris sejtbiológia gyógyászatban való felhasználását ma molekuláris gyógyászatnak nevezik .

A molekuláris biológia története

A molekuláris biológia a biokémia és a genetika metszéspontjában ül; ahogy ezek a tudományos tudományágak a 20. században megjelentek és fejlődtek, világossá vált, hogy mindkettő azon molekuláris mechanizmusok meghatározására törekszik, amelyek a létfontosságú sejtfunkciók hátterében állnak. A molekuláris biológia fejlődése szorosan összefügg az új technológiák kifejlesztésével és azok optimalizálásával. A molekuláris biológiát sok tudós munkája megvilágította, így a terület története e tudósok és kísérleteik megértésének függvénye.

Az egész a baktériumok átalakulásának jelenségével kezdődik, 1928-ban Frederick Griffith megfigyelte az egyik baktériumból a másikba való átalakulás jelenségét [jelenleg genetikai transzformációként ismert]. Akkor még nem tudta megmagyarázni az átalakulás jelenségét. Később, 1944-ben három tudós, Oswald Avery, Colin Macleod és Maclyn McCarty bemutatta a baktériumok átalakulásának teljes jelenségét. Két év után, 1930-ban a molekuláris biológia a tudomány hivatalos ágává vált. De a „molekuláris biológia” kifejezést csak 1938-ban találták ki, és ezt Warren Weaver tudós tette, aki a Rockefeller Alapítvány természettudományi igazgatójaként dolgozott.

A következő kísérletből arra a következtetésre jutottunk, hogy a DNS az alapvető genetikai anyag, amely a genetikai változásokat okozta. A DNS alapvető összetétele ismert volt, hogy négy bázist tartalmaz – adenint, guanint, timint és citozint. Tehát a kémiai összetétel és a Maurice Wilkins és Rosalind Franklin által végzett röntgenkrisztallográfia alapján a DNS szerkezetét James Watson és Francis Crick javasolta. De mielőtt Watson és Crick javasolta volna a DNS-szerkezetet, 1950-ben Erwin Chargaff osztrák származású tudós javasolta az elméletet/szabályt [ma Chargaff-szabályként ismert], amely kimondta, hogy az adenin és a timin, valamint a guanin és a citozin száma egyenlő. arány.

A Chargaff szabálya

"Chargaff szabálya kimondta, hogy bármely élőlényből származó DNS-ben a purin és a pirimidinek sztöchiometrikus aránya 1:1 (azaz A+G=T+C), és pontosabban a guanin mennyiségének meg kell egyeznie a citozin mennyiségével. és az adenin mennyiségének egyenlőnek kell lennie a timin mennyiségével . Ez a mintázat a DNS mindkét szálában megtalálható".

A genetika területe a genetikai öröklődés molekuláris mechanizmusainak és egy gén szerkezetének megértésére tett kísérletként jelent meg . Gregor Mendel volt az úttörője ennek a munkának 1866-ban, amikor először írta meg a genetikai öröklődés törvényeit a borsónövényeken végzett keresztezések tanulmányozása alapján. A genetikai öröklődés egyik ilyen törvénye a szegregáció törvénye, amely kimondja, hogy az egy adott génhez két alléllal rendelkező diploid egyedek ezek közül az allélok egyikét adják át utódaiknak. Kritikus munkája miatt a genetikai öröklődés tanulmányozását általában mendeli genetikának nevezik .

A molekuláris biológia egyik fő mérföldköve a DNS szerkezetének felfedezése volt. Ezt a munkát 1869-ben Friedrich Miescher, egy svájci biokémikus kezdte, aki először javasolta a nuklein nevű szerkezetet, amelyről ma már tudjuk, hogy dezoxiribonukleinsav vagy DNS. Ezt az egyedülálló anyagot a gennyes kötszerek összetevőinek tanulmányozása és a "foszfortartalmú anyagok" egyedi tulajdonságainak feltárásával fedezte fel. A DNS-modell másik jelentős közreműködője Phoebus Levene volt, aki élesztőn végzett biokémiai kísérletei eredményeként 1919-ben javasolta a DNS "polinukleotid modelljét". 1950-ben Erwin Chargaff kibővítette Levene munkáját, és rávilágított a nukleinsavak néhány kritikus tulajdonságára: először is, a nukleinsavak szekvenciája fajonként változik. Másodszor, a purinok (adenin és guanin) összkoncentrációja mindig megegyezik a pirimidinek (cisztein és timin) összkoncentrációjával. Ezt ma Chargaff-szabályként ismerik. 1953-ban James Watson és Francis Crick publikálta a DNS kettős spirális szerkezetét Rosalind Franklin és Maurice Wilkins röntgenkrisztallográfiás munkájának felhasználásával . Watson és Crick leírta a DNS szerkezetét, és sejtették ennek az egyedülálló szerkezetnek a DNS-replikáció lehetséges mechanizmusaira gyakorolt ​​hatását.

JD Watson és FHC Crick 1962-ben Nobel-díjat kapott Maurice Wilkens mellett a DNS szerkezetének modelljéért.

Az idő múlásával 1964-ben KA Marcker és Frederick Sanger felfedezett egy sajátos amioacil-tRNS-t az E. coliban, az úgynevezett N-formil-metionil-tRNS-t, és elmagyarázták, hogy ez a molekula szerepet játszik a lánc megnyúlásának speciális mechanizmusában. Második Nobel-díjjal jutalmazták az F 174 bakteriofág egyszálú DNS-ének 5400 nukleotidból álló teljes szekvenciájának felfedezéséért.

1961-ben kimutatták, hogy amikor egy gén egy fehérjét kódol, a gén DNS -ének három egymást követő bázisa határozza meg a fehérje minden egymást követő aminosavát. Így a genetikai kód egy triplett kód, ahol minden triplet (úgynevezett kodon) egy adott aminosavat határoz meg. Kimutatták továbbá, hogy a kodonok nem fedik át egymást a fehérjét kódoló DNS-szekvenciában, és minden szekvenciát egy rögzített kiindulási pontról olvasunk.

1962 és 1964 között egy bakteriális vírus feltételesen letális mutánsainak felhasználásával alapvető előrelépések történtek a DNS-replikáció, a DNS-javítás, a DNS-rekombináció és az összeállítás során használt fehérjék funkcióinak és kölcsönhatásainak megértésében. molekuláris szerkezetek.

Watson és Crick DNS-szerkezetének diagramszerű ábrázolása
Szögleírás a DNS szerkezetében

Az F. Griffith kísérlet

A kísérlet diagramos ábrázolása

1928-ban Fredrick Griffith olyan virulencia tulajdonsággal találkozott a pneumococcus baktériumokban, amelyek elpusztították a laboratóriumi patkányokat. Mendel szerint az akkoriban elterjedt génátvitel csak a szülőtől a leánysejtekig történhetett. Griffith egy másik elméletet terjesztett elő, kijelentve, hogy az azonos generáció tagjaiban végbemenő géntranszfert horizontális géntranszfernek (HGT) nevezik. Ezt a jelenséget ma genetikai átalakulásnak nevezik.

Griffith a Streptococcus pneumoniae baktériumokkal foglalkozott, amelyeknek két különböző törzse volt, az egyik virulens és sima, a másik pedig avirulens és durva. A sima törzs egyfajta specifikus poliszacharid – glükóz és glükuronsav kapszula polimerje – jelenléte miatt csillogó megjelenésű volt. A baktériumok poliszacharid rétege miatt a gazdaszervezet immunrendszere nem ismeri fel a baktériumokat, és megöli a gazdát. A másik, avirulens, durva törzsből hiányzik ez a poliszacharid kapszula, és tompa, durva megjelenésű.

A kapszula jelenléte vagy hiánya a törzsben ismert, hogy genetikailag meghatározott. A sima és durva alakzatok számos különböző típusban fordulnak elő, például SI, S-II, S-III stb. és RI, R-II, R-III stb. Az S és R baktériumok ezen altípusai különböznek egymástól az általuk termelt antigén típusában.

Hershey és Chase kísérlet

Hershey és Chase kísérlet

Hershey és Chase kísérlete erősítette meg, hogy a DNS az a genetikai anyag, amely a fertőzés oka. A kísérlethez E. colit és bakteriofágot használtak. Ezt a kísérletet turmixgép kísérletnek is nevezik, mivel a konyhai turmixgépet fő berendezésként használták. Alfred Hershey és Martha Chase bebizonyították, hogy a fágrészecske által egy baktériumba injektált DNS tartalmazza az utódfágrészecskék szintéziséhez szükséges összes információt. Radioaktivitást használva két különböző kémcsőbe címkézték a bakteriofág fehérjeburkolatát radioaktív kénnel és DNS-t radioaktív foszforral. A bakteriofág és az E. coli kémcsőbe való keverése után megkezdődik az inkubációs periódus, amelyben a fág átalakítja az E. coli sejtekben lévő genetikai anyagot. Ezután a keveréket összekeverjük vagy felrázzuk, ami elválasztja a fágot az E. coli sejtektől. Az egész elegyet centrifugáljuk, és az E. coli sejteket tartalmazó pelletet ellenőrizzük, és a felülúszót eldobjuk. Az E. coli sejtek radioaktív foszfort mutattak, ami azt jelzi, hogy a transzformált anyag DNS volt, nem pedig a fehérje burok.

A transzformált DNS az E. coli DNS-éhez kötődik, és a radioaktivitás csak a bakteriofág DNS-én látható. Ez a mutált DNS továbbadható a következő generációnak, és létrejött a transzdukció elmélete. A transzdukció egy olyan folyamat, amelyben a bakteriális DNS hordozza a bakteriofágok fragmentumát, és továbbadja azt a következő generációnak. Ez is egyfajta horizontális génátvitel.

Modern molekuláris biológia

A 20-as évek közepéhez közeledve a molekuláris biológia a vertikális és horizontális technikai fejlődés által meghatározott aranykorba lép. Vertikálisan az új technológiák lehetővé teszik a biológiai folyamatok atomi szintű valós idejű nyomon követését. A molekuláris biológusok manapság egyre nagyobb mélységben férhetnek hozzá az egyre megfizethetőbb szekvenálási adatokhoz, ami megkönnyíti az új genetikai manipulációs módszerek kifejlesztését új, nem modellszervezetekben. Hasonlóképpen, a szintetikus molekuláris biológusok a kis- és makromolekulák ipari előállítását fogják ösztönözni azáltal, hogy exogén metabolikus útvonalakat vezetnek be különböző prokarióta és eukarióta sejtvonalakban.

Vízszintesen az adatok szekvenálása egyre megfizethetőbbé válik, és számos különböző tudományterületen felhasználható. Ez előmozdítja az iparágak fejlődését a fejlődő országokban, és növeli a hozzáférést az egyes kutatók számára. Hasonlóképpen, a CRISPR-Cas9 génszerkesztési kísérleteket most már egyének is kitalálhatják és végrehajthatják 10 000 dollár alatt új organizmusokban, ami az ipari és orvosi alkalmazások fejlesztését fogja eredményezni.

Kapcsolat más biológiai tudományokkal

Sematikus kapcsolat a biokémia, a genetika és a molekuláris biológia között

Az alábbi lista egy nézőpontot ír le a molekuláris biológia és más kapcsolódó területek közötti interdiszciplináris kapcsolatokról.

Míg a kutatók a molekuláris biológiára jellemző technikákat alkalmaznak, gyakran előfordul, hogy ezeket a genetikai és biokémiai módszerekkel kombinálják . A molekuláris biológia nagy része kvantitatív, és az utóbbi időben jelentős mennyiségű munkát végeztek számítástechnikai technikák, például bioinformatika és számítógépes biológia felhasználásával . A molekuláris genetika, a génszerkezet és funkció tanulmányozása a 2000-es évek eleje óta a molekuláris biológia egyik legjelentősebb részterülete. A biológia más ágait a molekuláris biológia informálja, vagy közvetlenül tanulmányozzák a molekulák kölcsönhatásait saját jogukon, például a sejtbiológiában és a fejlődésbiológiában, vagy közvetve, ahol molekuláris technikákat használnak a populációk vagy fajok történelmi attribútumaira következtetni, mint pl. az evolúciós biológia olyan területei, mint a populációgenetika és a filogenetika . A biomolekulák "alapoktól" vagy molekulárisan, biofizikában is nagy hagyománya van .

A molekuláris biológia technikái

DNS animáció

Molekuláris klónozás

Transzdukciós kép

Molekuláris klónozást használnak a számunkra érdekes DNS-szekvencia izolálására, majd plazmidvektorba történő átvitelére. Ezt a rekombináns DNS-technológiát először az 1960-as években fejlesztették ki. Ebben a technikában a kérdéses fehérjét kódoló DNS -szekvenciát polimeráz láncreakció (PCR) és/vagy restrikciós enzimek segítségével klónozzák egy plazmidba ( expressziós vektor ). A plazmidvektor általában legalább 3 megkülönböztető tulajdonsággal rendelkezik: replikációs origó, többszörös klónozási hely (MCS) és szelektív marker (általában antibiotikum-rezisztencia ). Ezenkívül az MCS-től felfelé találhatók a promoter régiók és a transzkripció kezdőhelye, amelyek szabályozzák a klónozott gén expresszióját.

Ez a plazmid bakteriális vagy állati sejtekbe is beépíthető. A DNS baktériumsejtekbe történő bejuttatása történhet csupasz DNS felvételével, sejt-sejt érintkezés útján történő konjugációval vagy vírusvektoron keresztüli transzdukcióval . A DNS eukarióta sejtekbe, például állati sejtekbe fizikai vagy kémiai úton történő bejuttatását transzfekciónak nevezzük . Számos különböző transzfekciós technika áll rendelkezésre, mint például a kalcium-foszfátos transzfekció, az elektroporáció, a mikroinjekció és a liposzóma transzfekció . A plazmid beépülhet a genomba, ami stabil transzfekciót eredményez, vagy független maradhat a genomtól, és átmenetileg expresszálódik, ezt tranziens transzfekciónak nevezzük.

A kérdéses fehérjét kódoló DNS most egy sejt belsejében van, és a fehérje expresszálható. Különféle rendszerek, például indukálható promóterek és specifikus sejtjelző faktorok állnak rendelkezésre, amelyek elősegítik a kívánt fehérje magas szintű expresszióját. Ezután nagy mennyiségű fehérjét lehet kivonni a bakteriális vagy eukarióta sejtből. A fehérje enzimaktivitása többféle helyzetben is tesztelhető, a fehérje kristályosítható, így harmadlagos szerkezete is tanulmányozható, vagy a gyógyszeriparban új gyógyszerek fehérjével szembeni aktivitása vizsgálható.

Polimeráz láncreakció

A polimeráz láncreakció (PCR) egy rendkívül sokoldalú technika a DNS másolására. Röviden, a PCR lehetővé teszi egy adott DNS-szekvencia előre meghatározott módon történő másolását vagy módosítását. A reakció rendkívül erős, és tökéletes körülmények között egy DNS-molekulát 1,07 milliárd molekulává erősíthet kevesebb mint két óra alatt. A PCR-nek számos alkalmazása van, beleértve a génexpresszió tanulmányozását, a kórokozó mikroorganizmusok kimutatását, a genetikai mutációk kimutatását és a mutációk DNS-be való bejuttatását. A PCR technika használható restrikciós enzimhelyek bejuttatására a DNS-molekulák végére, vagy a DNS bizonyos bázisainak mutálására, ez utóbbi egy helyspecifikus mutagenezisnek nevezett módszer . A PCR használható annak meghatározására is, hogy egy adott DNS-fragmens megtalálható-e a cDNS-könyvtárban . A PCR-nek számos változata van, mint például a reverz transzkripciós PCR ( RT-PCR ) az RNS amplifikálására, és újabban a kvantitatív PCR, amely lehetővé teszi a DNS- vagy RNS-molekulák kvantitatív mérését.

Gél elektroforézis

SDS-OLDAL

A gélelektroforézis egy olyan technika, amely a molekulákat méretük szerint választja el agaróz vagy poliakrilamid gél segítségével. Ez a technika a molekuláris biológia egyik fő eszköze. Az alapelv az, hogy a DNS-fragmensek szétválaszthatók elektromos áram segítségével a gélen – mivel a DNS-váz negatív töltésű foszfátcsoportokat tartalmaz, a DNS átvándorol az agaróz gélen az áram pozitív vége felé. A fehérjék szétválaszthatók méretük alapján is SDS-PAGE gél segítségével, vagy méretük és elektromos töltésük alapján úgynevezett 2D gélelektroforézissel .

PAGE gélen Coomassie blue festékkel megfestett fehérjék.

A Bradford Assay

A Bradford Assay egy molekuláris biológiai technika, amely lehetővé teszi a fehérjemolekulák gyors és pontos mennyiségi meghatározását a Coomassie Brilliant Blue G-250 nevű festék egyedi tulajdonságainak felhasználásával. A Coomassie Blue látható színeltolódáson megy keresztül a vörösesbarnáról az élénkkékre, amikor a fehérjéhez kötődik. Instabil, kationos állapotában a Coomassie Blue háttérhullámhossza 465 nm, és vörösesbarna színt ad. Amikor a Coomassie Blue fehérjéhez kötődik savas oldatban, a háttér hullámhossza 595 nm-re tolódik el, és a festék élénk kék színt ad. A vizsgálatban szereplő fehérjék körülbelül 2 perc alatt megkötik a Coomassie blue-t, és a fehérje-festék komplex körülbelül egy órán keresztül stabil, bár ajánlott az abszorbancia mérése a reakció megkezdése után 5-20 percen belül. A Bradford-tesztben a fehérje koncentrációja ezután látható fény spektrofotométerrel mérhető, ezért nincs szükség nagy felszerelésre.

Ezt a módszert 1975-ben fejlesztette ki Marion M. Bradford, és lényegesen gyorsabb, pontosabb fehérjemennyiség meghatározását tette lehetővé a korábbi módszerekhez képest: a Lowry-eljáráshoz és a biuret-vizsgálathoz. Az előző módszerekkel ellentétben a Bradford-teszt nem érzékeny számos nem fehérje molekula, köztük az etanol, a nátrium-klorid és a magnézium-klorid általi interferenciára. Azonban érzékeny az erős lúgos pufferanyagok, például a nátrium-dodecil-szulfát (SDS) hatására.

Makromolekula blottolás és szondázás

A northern, western és eastern blotting kifejezések eredetileg egy molekuláris biológiai viccből származnak, amely a Southern blotting kifejezést játszotta, az Edwin Southern által a blottolt DNS hibridizálására leírt technikát követően . Patricia Thomas, a Northern blot néven ismert RNS-blot fejlesztője valójában nem használta ezt a kifejezést.

Southern blotting

Feltalálójáról, Edwin Southern biológusról elnevezett Southern blot egy olyan módszer, amellyel egy DNS-mintában egy adott DNS-szekvencia jelenlétét vizsgálják. A restrikciós enzimes (restrikciós endonukleáz) emésztés előtt vagy után vett DNS-mintákat gélelektroforézissel elválasztják, majd kapilláris hatáson keresztül blottolással egy membránra visszük át . A membránt ezután egy jelölt DNS-próbának tesszük ki, amely komplement bázisszekvenciát tartalmaz a kérdéses DNS-en lévő szekvenciához. A Southern blottingot kevésbé használják a laboratóriumi tudományban, mivel más technikák, például a PCR képesek DNS-mintákból specifikus DNS-szekvenciákat kimutatni. Ezeket a blotokat azonban még mindig használják bizonyos alkalmazásokhoz, például a transzgén kópiaszámának mérésére transzgenikus egerekben vagy a génkiütött embrionális őssejtvonalak tervezésében .

Northern blot

Northern blot diagram

A Northern blot -ot specifikus RNS-molekulák jelenlétének tanulmányozására használják különböző RNS-minták relatív összehasonlításaként. Ez lényegében a denaturáló RNS gélelektroforézis és egy blot kombinációja . Ebben a folyamatban az RNS-t a méret alapján választják el, majd egy membránra visszük át, amelyet azután a kérdéses szekvencia jelölt komplementjével vizsgálnak. Az eredmények a használt címkétől függően többféleképpen is megjeleníthetők; a legtöbb azonban a mintában kimutatott RNS méretét reprezentáló sávok feltárását eredményezi. Ezen sávok intenzitása a vizsgált mintákban lévő cél RNS mennyiségével függ össze. Az eljárást általában arra használják, hogy tanulmányozzák, mikor és mennyi génexpresszió fordul elő, annak mérésével, hogy az adott RNS-ből mennyi van jelen a különböző mintákban, feltételezve, hogy nem történik utótranszkripciós szabályozás, és az mRNS szintjei a megfelelő fehérje arányos szintjét tükrözik. előállított. Ez az egyik legalapvetőbb eszköz annak meghatározására, hogy bizonyos gének mikor és milyen körülmények között fejeződnek ki élő szövetekben.

Western blot

A Western blot egy olyan technika, amellyel specifikus fehérjéket lehet kimutatni fehérjék keverékéből. Western blot segítségével meghatározhatjuk az izolált fehérjék méretét, valamint mennyiségileg meghatározhatjuk expressziójukat. A Western-blot során a fehérjéket először méretük szerint választják el egy vékony gélben, amelyet két üveglap közé helyeznek az SDS-PAGE néven ismert technikával . A gélben lévő fehérjék ezután polivinilidén-fluoridra (PVDF), nitrocellulózra, nejlonra vagy más hordozó membránra kerülnek. Ezt a membránt ezután ellenanyagoldatokkal lehet szondázni . Azok az antitestek, amelyek specifikusan kötődnek a kérdéses fehérjéhez, számos technikával láthatóvá tehetők, beleértve a színes termékeket, a kemilumineszcenciát vagy az autoradiográfiát . Az antitesteket gyakran enzimekkel jelölik. Ha egy kemilumineszcens szubsztrátot az enzim hatásának tesznek ki, az lehetővé teszi a kimutatást. A Western blot technikák használata nemcsak detektálást tesz lehetővé, hanem kvantitatív elemzést is. A Western blottal analóg módszerek használhatók specifikus fehérjék közvetlen megfestésére élő sejtekben vagy szövetmetszetekben .

Eastern blotting

Az eastern blot technikát a fehérjék poszttranszlációs módosulásának kimutatására használják. A PVDF-re vagy nitrocellulóz membránra blottolt fehérjéket specifikus szubsztrátokkal vizsgálják meg a módosítások szempontjából.

Mikrotömbök

Egy DNS-microarray nyomtatása folyamatban van
A célpont hibridizálása a szondával

A DNS-mikroarray szilárd hordozóhoz, például mikroszkóp tárgylemezhez kapcsolódó foltok gyűjteménye, ahol minden folt egy vagy több egyszálú DNS- oligonukleotid fragmentumot tartalmaz. A tömbök lehetővé teszik nagy mennyiségű nagyon kicsi (100 mikrométer átmérőjű) foltok rögzítését egyetlen tárgylemezre. Minden foltnak van egy DNS-fragmens molekulája, amely komplementer egyetlen DNS-szekvenciával . Ennek a technikának egy változata lehetővé teszi egy szervezet génexpressziójának minősítését a fejlődés egy adott szakaszában ( expressziós profilalkotás ). Ezzel a technikával a szövetben lévő RNS-t izolálják és jelzett komplementer DNS -vé (cDNS) alakítják. Ezt a cDNS-t azután hibridizáljuk a tömb fragmenseivel, és a hibridizáció láthatóvá válik. Mivel több tömb is készíthető pontosan azonos pozíciójú fragmensekkel, különösen hasznosak két különböző szövet, például egy egészséges és rákos szövet génexpressziójának összehasonlítására. Azt is meg lehet mérni, hogy mely gének expresszálódnak, és hogyan változik ez az expresszió az idő múlásával vagy más tényezők hatására. A mikrotömbök előállításának számos különböző módja van; a legelterjedtebbek a szilícium chipek, a ~100 mikrométer átmérőjű foltokkal rendelkező mikroszkóp tárgylemezek, az egyedi tömbök és a porózus membránokon nagyobb foltokkal rendelkező tömbök (macroarrays). Egy adott tömbön 100-tól több mint 10 000-ig terjedő hely lehet. A DNS-től eltérő molekulákkal is készíthetők tömbök.

Allélspecifikus oligonukleotid

Az allélspecifikus oligonukleotid (ASO) egy olyan technika, amely lehetővé teszi az egybázisos mutációk kimutatását PCR vagy gélelektroforézis nélkül. A rövid (20-25 nukleotid hosszúságú), jelölt próbák a nem fragmentált cél-DNS-nek vannak kitéve, a hibridizáció a próbák rövid hosszának köszönhetően nagy specificitással megy végbe, és egyetlen báziscsere is akadályozza a hibridizációt. A cél-DNS-t ezután mossuk, és a nem hibridizálódó jelölt próbákat eltávolítjuk. A cél-DNS-t ezután radioaktivitás vagy fluoreszcencia segítségével elemezzük a próba jelenlétére. Ebben a kísérletben, mint a legtöbb molekuláris biológiai technikában, kontrollt kell használni a sikeres kísérletezés érdekében.

A molekuláris biológiában folyamatosan fejlesztik az eljárásokat és technológiákat, és elhagyják a régebbi technológiákat. Például a DNS gélelektroforézis ( agaróz vagy poliakrilamid ) megjelenése előtt a DNS-molekulák méretét jellemzően a szacharóz gradiensekben történő ülepedési sebesség határozta meg, amely lassú és munkaigényes technika, amely drága műszerezést igényel; a szacharóz gradiensek előtt viszkozimetriát alkalmaztunk. Történelmi érdekességük mellett gyakran érdemes ismerni a régebbi technológiát, mivel alkalmanként hasznos egy újabb probléma megoldása, amelyre az újabb technika nem megfelelő.

Lásd még

Hivatkozások

További irodalom

Külső linkek