Biologia molecolare -Molecular biology

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Biologia molecolare / m ə ˈ l ɛ k j ʊ l ər / è la branca della biologia che cerca di comprendere le basi molecolari dell'attività biologica all'interno e tra le cellule, inclusa la sintesi molecolare, la modifica, i meccanismi e le interazioni. Lo studio della struttura chimica e fisica delle macromolecole biologiche è noto come biologia molecolare.

La biologia molecolare è stata inizialmente descritta come un approccio incentrato sulle basi dei fenomeni biologici: scoprire le strutture delle molecole biologiche e le loro interazioni e come queste interazioni spiegano le osservazioni della biologia classica.

Nel 1945 il termine biologia molecolare fu usato dal fisico William Astbury. Lo sviluppo nel campo della biologia molecolare è avvenuto molto tardi da comprendere che il sistema complesso o l'approccio vantaggioso sarebbe stato realizzato in un modo semplice di comprensione utilizzando batteri e batteriofagi questo organismo fornisce informazioni sul processo biologico di base più prontamente rispetto alle cellule animali. Nel 1953 poi due giovani di nome Francis Crick e James Watson che lavoravano presso l'unità del Medical Research Council, laboratorio Cavendish, Cambridge (ora MRC Laboratory of Molecular Biology ), realizzarono un modello a doppia elica del DNA che cambiò l'intero scenario di ricerca che proponevano il DNA struttura basata su ricerche precedenti condotte da Rosalind Franklin e Maurice Wilkins, quindi la ricerca ha portato a trovare materiale DNA in altri microrganismi, piante e animali.

La biologia molecolare non è semplicemente lo studio delle molecole biologiche e delle loro interazioni; piuttosto, è anche una raccolta di tecniche sviluppate sin dalla genesi del campo che hanno consentito agli scienziati di conoscere i processi molecolari. Una tecnica notevole che ha rivoluzionato il campo è la reazione a catena della polimerasi (PCR), sviluppata nel 1983. La PCR è una reazione che amplifica piccole quantità di DNA ed è utilizzata in molte applicazioni in discipline scientifiche, come verrà discusso in seguito .

Il dogma centrale della biologia molecolare descrive il processo in cui il DNA viene trascritto in RNA, che viene poi tradotto in proteine.

La biologia molecolare svolge anche un ruolo fondamentale nella comprensione di strutture, funzioni e controlli interni all'interno delle singole cellule, che possono essere tutti utilizzati per indirizzare in modo efficiente nuovi farmaci, diagnosticare malattie e comprendere meglio la fisiologia cellulare. Alcune ricerche cliniche e terapie mediche derivanti dalla biologia molecolare sono coperte dalla terapia genica, mentre l'uso della biologia molecolare o della biologia cellulare molecolare in medicina è ora indicato come medicina molecolare .

Storia della biologia molecolare

La biologia molecolare si trova all'incrocio tra biochimica e genetica; quando queste discipline scientifiche sono emerse e si sono evolute nel 20° secolo, è diventato chiaro che entrambe cercavano di determinare i meccanismi molecolari che sono alla base delle funzioni cellulari vitali. I progressi della biologia molecolare sono stati strettamente correlati allo sviluppo di nuove tecnologie e alla loro ottimizzazione. La biologia molecolare è stata chiarita dal lavoro di molti scienziati, e quindi la storia del campo dipende dalla comprensione di questi scienziati e dei loro esperimenti.

Tutto inizia con il fenomeno della trasformazione nei batteri, nel 1928, Frederick Griffith, osservò un fenomeno di trasformazione da un batterio all'altro [ora noto come trasformazione genetica]. A quel tempo, non poteva spiegare il fenomeno della trasformazione. Più tardi, nel 1944, tre scienziati Oswald Avery, Colin Macleod e Maclyn McCarty dimostrarono l'intero fenomeno della trasformazione nei batteri. Dopo, due anni nel 1930, la biologia molecolare fu istituita come branca ufficiale della scienza. Ma il termine "Biologia Molecolare" non è stato coniato fino al 1938 e ciò è stato fatto dallo scienziato Warren Weaver, che lavorava come direttore delle scienze naturali presso la Rockefeller Foundation.

Dal seguente esperimento si è concluso che il DNA è il materiale genetico di base che ha causato i cambiamenti genetici. Si sapeva che la composizione di base del DNA contiene quattro basi conosciute come: adenina, guanina, timina e citosina. Quindi, sulla base della composizione chimica e della cristallografia a raggi X, fatta da Maurice Wilkins e Rosalind Franklin, la struttura del DNA è stata proposta da James Watson e Francis Crick. Ma, prima che Watson e Crick proponessero la struttura del DNA, nel 1950 lo scienziato austriaco Erwin Chargaff, propose la teoria / regola [oggi nota come regola di Chargaff], che affermava che il numero di adenina e timina e guanina e citosina sono uguali proporzione.

La regola di Chargaff

"La regola di Chargaff affermava che il DNA di qualsiasi specie di qualsiasi organismo dovrebbe avere un rapporto stechiometrico 1:1 di purine e pirimidine (cioè, A+G=T+C) e, più specificamente, che la quantità di guanina dovrebbe essere uguale alla citosina e la quantità di adenina dovrebbe essere uguale alla timina . Questo schema si trova in entrambi i filamenti del DNA".

Il campo della genetica è nato come tentativo di comprendere i meccanismi molecolari dell'eredità genetica e la struttura di un gene . Gregor Mendel ha aperto la strada a questo lavoro nel 1866, quando ha scritto per la prima volta le leggi dell'eredità genetica sulla base dei suoi studi sugli incroci di accoppiamento nelle piante di piselli. Una di queste leggi dell'eredità genetica è la legge di segregazione, che afferma che gli individui diploidi con due alleli per un particolare gene trasmettono uno di questi alleli alla loro prole. A causa del suo lavoro critico, lo studio dell'eredità genetica viene comunemente chiamato genetica mendeliana .

Una pietra miliare importante nella biologia molecolare è stata la scoperta della struttura del DNA. Questo lavoro iniziò nel 1869 da Friedrich Miescher, un biochimico svizzero che per primo propose una struttura chiamata nucleina, che ora sappiamo essere acido desossiribonucleico, o DNA. Ha scoperto questa sostanza unica studiando i componenti delle bende piene di pus e notando le proprietà uniche delle "sostanze contenenti fosforo". Un altro notevole contributo al modello del DNA è stato Phoebus Levene, che ha proposto il "modello polinucleotidico" del DNA nel 1919 come risultato dei suoi esperimenti biochimici sul lievito. Nel 1950, Erwin Chargaff ha ampliato il lavoro di Levene e ha chiarito alcune proprietà critiche degli acidi nucleici: in primo luogo, la sequenza degli acidi nucleici varia tra le specie. In secondo luogo, la concentrazione totale di purine (adenina e guanina) è sempre uguale alla concentrazione totale di pirimidine (cisteina e timina). Questa è ora nota come regola di Chargaff. Nel 1953, James Watson e Francis Crick pubblicarono la struttura a doppia elica del DNA, utilizzando il lavoro di cristallografia a raggi X svolto da Rosalind Franklin e Maurice Wilkins . Watson e Crick hanno descritto la struttura del DNA e hanno ipotizzato le implicazioni di questa struttura unica per i possibili meccanismi di replicazione del DNA.

JD Watson e FHC Crick ricevettero il premio Nobel nel 1962, insieme a Maurice Wilkens, per aver proposto un modello della struttura del DNA.

Col passare del tempo, nel 1964 KA Marcker e Frederick Sanger scoprirono un peculiare amioacil-tRNA in E.coli, chiamato N-formil-metionil-tRNA e spiegarono che questa molecola gioca un ruolo nel meccanismo speciale dell'allungamento della catena. È stato insignito del secondo premio Nobel per aver scoperto la sequenza completa di 5.400 nucleotidi di DNA a singolo filamento di batteriofagi F ´ 174.

Nel 1961, è stato dimostrato che quando un gene codifica una proteina, tre basi sequenziali del DNA di un gene specificano ciascun amminoacido successivo della proteina. Quindi il codice genetico è un codice di tripletta, in cui ciascuna tripletta (chiamata codone) specifica un particolare amminoacido. Inoltre, è stato dimostrato che i codoni non si sovrappongono tra loro nella sequenza di DNA che codifica per una proteina e che ogni sequenza viene letta da un punto di partenza fisso.

Durante il 1962-1964, attraverso l'uso di mutanti letali condizionali di un virus batterico, furono compiuti progressi fondamentali nella nostra comprensione delle funzioni e delle interazioni delle proteine ​​impiegate nel meccanismo di replicazione del DNA, riparazione del DNA, ricombinazione del DNA e nell'assemblaggio delle strutture molecolari.

Rappresentazione schematica della struttura del DNA di Watson e Crick
Descrizione dell'angolo nella struttura del DNA

L'esperimento di F.Griffith

Rappresentazione schematica dell'esperimento

Nel 1928, Fredrick Griffith, incontrò una proprietà di virulenza nei batteri del pneumococco, che stava uccidendo i topi da laboratorio. Secondo Mendel, prevalente a quel tempo, il trasferimento genico poteva avvenire solo dalle cellule madri a quelle figlie. Griffith ha avanzato un'altra teoria, affermando che il trasferimento genico che si verifica in membri della stessa generazione è noto come trasferimento genico orizzontale (HGT). Questo fenomeno viene ora chiamato trasformazione genetica.

Griffith ha affrontato i batteri Streptococcus pneumoniae, che avevano due ceppi diversi, uno virulento e liscio e uno avirulento e ruvido. Il ceppo liscio aveva un aspetto brillante a causa della presenza di un tipo di polisaccaride specifico, un polimero di glucosio e una capsula di acido glucuronico. A causa di questo strato di batteri polisaccaridi, il sistema immunitario di un ospite non può riconoscere i batteri e uccide l'ospite. L'altro ceppo avirulento e ruvido è privo di questa capsula polisaccaridica e ha un aspetto opaco e ruvido.

È noto che la presenza o l'assenza di capsula nel ceppo è determinata geneticamente. Ceppi lisci e ruvidi si verificano in diversi tipi come SI, S-II, S-III, ecc. e RI, R-II, R-III, ecc. rispettivamente. Tutti questi sottotipi di batteri S e R differiscono tra loro per il tipo di antigene che producono.

Hershey e Chase sperimentano

Hershey e Chase sperimentano

La conferma che il DNA è il materiale genetico che causa l'infezione è arrivata dall'esperimento di Hershey e Chase. Hanno usato E.coli e batteriofago per l'esperimento. Questo esperimento è anche noto come esperimento del frullatore, poiché il frullatore da cucina è stato utilizzato come un importante apparato. Alfred Hershey e Martha Chase hanno dimostrato che il DNA iniettato da una particella fagica in un batterio contiene tutte le informazioni necessarie per sintetizzare le particelle fagiche della progenie. Hanno usato la radioattività per etichettare il rivestimento proteico del batteriofago con zolfo radioattivo e il DNA con fosforo radioattivo, rispettivamente in due diverse provette. Dopo aver mescolato batteriofago ed E.coli nella provetta, inizia il periodo di incubazione in cui il fago trasforma il materiale genetico nelle cellule di E.coli . Quindi la miscela viene miscelata o agitata, che separa il fago dalle cellule di E.coli . L'intera miscela viene centrifugata e il pellet che contiene cellule di E.coli è stato controllato e il surnatante è stato scartato. Le cellule di E.coli hanno mostrato fosforo radioattivo, che indicava che il materiale trasformato era il DNA e non il rivestimento proteico.

Il DNA trasformato si attacca al DNA di E.coli e la radioattività è visibile solo sul DNA del batteriofago. Questo DNA mutato può essere passato alla generazione successiva e la teoria della trasduzione è nata. La trasduzione è un processo in cui il DNA batterico trasporta il frammento di batteriofagi e lo trasmette alla generazione successiva. Questo è anche un tipo di trasferimento genico orizzontale.

Biologia molecolare moderna

Mentre ci avviciniamo alla metà degli anni '20, la biologia molecolare sta entrando in un'età dell'oro definita dallo sviluppo tecnico sia verticale che orizzontale. Verticalmente, le nuove tecnologie consentono il monitoraggio in tempo reale dei processi biologici a livello atomico. I biologi molecolari oggi hanno accesso a dati di sequenziamento sempre più convenienti a profondità sempre più elevate, facilitando lo sviluppo di nuovi metodi di manipolazione genetica in nuovi organismi non modello. Allo stesso modo, i biologi molecolari sintetici guideranno la produzione industriale di piccole e macro molecole attraverso l'introduzione di vie metaboliche esogene in varie linee cellulari procariotiche ed eucariotiche.

Orizzontalmente, il sequenziamento dei dati sta diventando più accessibile e utilizzato in molti campi scientifici diversi. Ciò guiderà lo sviluppo delle industrie nei paesi in via di sviluppo e aumenterà l'accessibilità ai singoli ricercatori. Allo stesso modo, gli esperimenti di modifica genetica CRISPR-Cas9 possono ora essere concepiti e implementati da individui per meno di $ 10.000 in nuovi organismi, che guideranno lo sviluppo di applicazioni industriali e mediche

Rapporti con altre scienze biologiche

Relazione schematica tra biochimica, genetica e biologia molecolare

L'elenco seguente descrive un punto di vista sulle relazioni interdisciplinari tra la biologia molecolare e altri campi correlati.

Mentre i ricercatori praticano tecniche specifiche della biologia molecolare, è comune combinarle con metodi di genetica e biochimica . Gran parte della biologia molecolare è quantitativa e recentemente una notevole quantità di lavoro è stata svolta utilizzando tecniche informatiche come la bioinformatica e la biologia computazionale . La genetica molecolare, lo studio della struttura e della funzione dei geni, è stata tra i sottocampi più importanti della biologia molecolare dall'inizio degli anni 2000. Altre branche della biologia sono informate dalla biologia molecolare, studiando direttamente le interazioni delle molecole a sé stanti come nella biologia cellulare e nella biologia dello sviluppo, o indirettamente, dove le tecniche molecolari vengono utilizzate per dedurre attributi storici di popolazioni o specie, come in campi della biologia evolutiva come la genetica delle popolazioni e la filogenetica . C'è anche una lunga tradizione di studio delle biomolecole "da zero", o molecolarmente, in biofisica .

Tecniche di biologia molecolare

Animazione del DNA

Clonazione molecolare

Immagine di trasduzione

La clonazione molecolare viene utilizzata per isolare e quindi trasferire una sequenza di DNA di interesse in un vettore plasmidico. Questa tecnologia del DNA ricombinante è stata sviluppata per la prima volta negli anni '60. In questa tecnica, una sequenza di DNA codificante per una proteina di interesse viene clonata utilizzando la reazione a catena della polimerasi (PCR) e/o enzimi di restrizione in un plasmide ( vettore di espressione ). Il vettore plasmidico di solito ha almeno 3 caratteristiche distintive: un'origine di replicazione, un sito di clonazione multiplo (MCS) e un marcatore selettivo (di solito resistenza agli antibiotici ). Inoltre, a monte della MCS ci sono le regioni del promotore e il sito di inizio della trascrizione, che regolano l'espressione del gene clonato.

Questo plasmide può essere inserito in cellule batteriche o animali. L'introduzione del DNA nelle cellule batteriche può essere effettuata mediante trasformazione tramite assorbimento di DNA nudo, coniugazione tramite contatto cellula-cellula o trasduzione tramite vettore virale. L'introduzione del DNA nelle cellule eucariotiche, come le cellule animali, con mezzi fisici o chimici è chiamata trasfezione . Sono disponibili diverse tecniche di trasfezione, come la trasfezione con fosfato di calcio, l' elettroporazione, la microiniezione e la trasfezione di liposomi . Il plasmide può essere integrato nel genoma, determinando una trasfezione stabile, oppure può rimanere indipendente dal genoma ed espresso temporaneamente, chiamato trasfezione transitoria.

La codifica del DNA per una proteina di interesse è ora all'interno di una cellula e la proteina può ora essere espressa. Una varietà di sistemi, come promotori inducibili e specifici fattori di segnalazione cellulare, sono disponibili per aiutare a esprimere la proteina di interesse a livelli elevati. Grandi quantità di una proteina possono quindi essere estratte dalla cellula batterica o eucariotica. La proteina può essere testata per l'attività enzimatica in una varietà di situazioni, la proteina può essere cristallizzata in modo da poterne studiare la struttura terziaria o, nell'industria farmaceutica, può essere studiata l'attività di nuovi farmaci contro la proteina.

Reazione a catena della polimerasi

La reazione a catena della polimerasi (PCR) è una tecnica estremamente versatile per copiare il DNA. In breve, la PCR consente di copiare o modificare una specifica sequenza di DNA in modi predeterminati. La reazione è estremamente potente e in condizioni perfette potrebbe amplificare una molecola di DNA fino a diventare 1,07 miliardi di molecole in meno di due ore. La PCR ha molte applicazioni, tra cui lo studio dell'espressione genica, il rilevamento di microrganismi patogeni, il rilevamento di mutazioni genetiche e l'introduzione di mutazioni nel DNA. La tecnica PCR può essere utilizzata per introdurre siti di enzimi di restrizione alle estremità delle molecole di DNA, o per mutare particolari basi di DNA, quest'ultimo è un metodo denominato mutagenesi sito-diretta . La PCR può essere utilizzata anche per determinare se un particolare frammento di DNA si trova in una libreria di cDNA . La PCR ha molte varianti, come la PCR a trascrizione inversa ( RT-PCR ) per l'amplificazione dell'RNA e, più recentemente, la PCR quantitativa che consentono la misurazione quantitativa di molecole di DNA o RNA.

Gel di agarosio al due percento in tampone borato colato in un vassoio di gel.

Elettroforesi su gel

PAGINA SDS

L'elettroforesi su gel è una tecnica che separa le molecole in base alle loro dimensioni utilizzando un gel di agarosio o poliacrilammide. Questa tecnica è uno dei principali strumenti della biologia molecolare. Il principio di base è che i frammenti di DNA possono essere separati applicando una corrente elettrica attraverso il gel - poiché la spina dorsale del DNA contiene gruppi fosfato carichi negativamente, il DNA migrerà attraverso il gel di agarosio verso l'estremità positiva della corrente. Le proteine ​​possono anche essere separate in base alle dimensioni utilizzando un gel SDS-PAGE, o in base alle dimensioni e alla loro carica elettrica utilizzando quella che è nota come elettroforesi su gel 2D .

Proteine ​​colorate su un gel PAGE usando il colorante blu Coomassie.

Il saggio di Bradford

Il Bradford Assay è una tecnica di biologia molecolare che consente la quantificazione rapida e accurata delle molecole proteiche utilizzando le proprietà uniche di un colorante chiamato Coomassie Brilliant Blue G-250. Il Coomassie Blue subisce un cambiamento di colore visibile dal bruno-rossastro al blu brillante quando si lega alle proteine. Nel suo stato instabile e cationico, Coomassie Blue ha una lunghezza d'onda di fondo di 465 nm ed emana un colore bruno-rossastro. Quando il Coomassie Blue si lega alle proteine ​​in una soluzione acida, la lunghezza d'onda di fondo si sposta a 595 nm e il colorante emette un colore blu brillante. Le proteine ​​nel test legano il Coomassie blue in circa 2 minuti e il complesso proteina-colorante è stabile per circa un'ora, sebbene si consiglia di eseguire le letture dell'assorbanza entro 5-20 minuti dall'inizio della reazione. La concentrazione di proteine ​​nel saggio Bradford può quindi essere misurata utilizzando uno spettrofotometro a luce visibile e quindi non richiede attrezzature estese.

Questo metodo è stato sviluppato nel 1975 da Marion M. Bradford e ha consentito una quantificazione delle proteine ​​significativamente più rapida e accurata rispetto ai metodi precedenti: la procedura di Lowry e il dosaggio del biureto. A differenza dei metodi precedenti, il saggio Bradford non è suscettibile all'interferenza di diverse molecole non proteiche, tra cui etanolo, cloruro di sodio e cloruro di magnesio. Tuttavia, è suscettibile all'influenza di forti agenti tamponanti alcalini, come il sodio dodecil solfato (SDS).

Macchiare e sondare le macromolecole

I termini Northern, Western e Eastern blotting derivano da quello che inizialmente era uno scherzo di biologia molecolare che giocava sul termine Southern blotting, dopo la tecnica descritta da Edwin Southern per l'ibridazione del DNA blotted. Patricia Thomas, sviluppatrice dell'RNA blot che poi divenne noto come Northern blot, in realtà non usò il termine.

Macchia del sud

Prende il nome dal suo inventore, il biologo Edwin Southern, il Southern blot è un metodo per sondare la presenza di una specifica sequenza di DNA all'interno di un campione di DNA. I campioni di DNA prima o dopo la digestione dell'enzima di restrizione (endonucleasi di restrizione) vengono separati mediante elettroforesi su gel e quindi trasferiti su una membrana mediante blotting tramite azione capillare . La membrana viene quindi esposta a una sonda di DNA marcata che ha una sequenza di base complementare alla sequenza sul DNA di interesse. Il Southern blotting è meno comunemente usato nelle scienze di laboratorio a causa della capacità di altre tecniche, come la PCR, di rilevare specifiche sequenze di DNA da campioni di DNA. Queste macchie sono ancora utilizzate per alcune applicazioni, tuttavia, come la misurazione del numero di copie del transgene nei topi transgenici o nell'ingegneria di linee di cellule staminali embrionali ad eliminazione diretta del gene .

Macchia del nord

Diagramma della macchia nordica

Il Northern blot viene utilizzato per studiare la presenza di molecole di RNA specifiche come confronto relativo tra un insieme di diversi campioni di RNA. È essenzialmente una combinazione di elettroforesi su gel di RNA denaturante e una macchia . In questo processo l'RNA viene separato in base alle dimensioni e quindi trasferito su una membrana che viene quindi sondata con un complemento marcato di una sequenza di interesse. I risultati possono essere visualizzati in vari modi a seconda dell'etichetta utilizzata; tuttavia, la maggior parte risulta nella rivelazione di bande che rappresentano le dimensioni dell'RNA rilevato nel campione. L'intensità di queste bande è correlata alla quantità di RNA bersaglio nei campioni analizzati. La procedura è comunemente usata per studiare quando e quanta espressione genica si sta verificando misurando quanto di quell'RNA è presente in diversi campioni, assumendo che non si verifichi alcuna regolazione post-trascrizionale e che i livelli di mRNA riflettano livelli proporzionali della proteina corrispondente. prodotto. È uno degli strumenti più basilari per determinare a che ora e in quali condizioni determinati geni sono espressi nei tessuti viventi.

macchia occidentale

Un western blot è una tecnica mediante la quale è possibile rilevare proteine ​​specifiche da una miscela di proteine. I western blot possono essere utilizzati per determinare la dimensione delle proteine ​​isolate e per quantificarne l'espressione. Nel western blotting, le proteine ​​vengono prima separate per dimensione, in un gel sottile inserito tra due lastre di vetro con una tecnica nota come SDS-PAGE . Le proteine ​​nel gel vengono quindi trasferite su una membrana di fluoruro di polivinilidene (PVDF), nitrocellulosa, nylon o altra membrana di supporto. Questa membrana può quindi essere sondata con soluzioni di anticorpi . Gli anticorpi che si legano in modo specifico alla proteina di interesse possono quindi essere visualizzati mediante una varietà di tecniche, inclusi prodotti colorati, chemiluminescenza o autoradiografia . Spesso, gli anticorpi sono etichettati con enzimi. Quando un substrato chemiluminescente viene esposto all'enzima, ne consente il rilevamento. L'uso delle tecniche di western blotting consente non solo il rilevamento ma anche l'analisi quantitativa. Metodi analoghi al western blotting possono essere utilizzati per colorare direttamente proteine ​​specifiche in cellule vive o sezioni di tessuto .

Macchia orientale

La tecnica del blotting orientale viene utilizzata per rilevare la modifica post-traduzionale delle proteine. Le proteine ​​​​macchiate sulla membrana in PVDF o nitrocellulosa vengono sondate per le modifiche utilizzando substrati specifici.

Microarray

Un microarray di DNA in fase di stampa
Ibridazione da bersaglio a sonda

Un microarray di DNA è una raccolta di punti attaccati a un supporto solido come un vetrino da microscopio in cui ogni punto contiene uno o più frammenti di oligonucleotidi di DNA a filamento singolo. Gli array consentono di depositare grandi quantità di punti molto piccoli (100 micrometri di diametro) su un singolo vetrino. Ogni punto ha una molecola di frammento di DNA che è complementare a una singola sequenza di DNA . Una variante di questa tecnica permette di qualificare l'espressione genica di un organismo in una particolare fase di sviluppo ( expression profiling ). In questa tecnica l'RNA in un tessuto viene isolato e convertito in DNA complementare marcato (cDNA). Questo cDNA viene quindi ibridato con i frammenti sull'array e può essere eseguita la visualizzazione dell'ibridazione. Poiché è possibile creare più array con esattamente la stessa posizione dei frammenti, sono particolarmente utili per confrontare l'espressione genica di due tessuti diversi, come un tessuto sano e canceroso. Inoltre, si può misurare quali geni sono espressi e come tale espressione cambia nel tempo o con altri fattori. Esistono molti modi diversi per fabbricare microarray; i più comuni sono chip di silicio, vetrini da microscopio con punti di circa 100 micrometri di diametro, array personalizzati e array con punti più grandi su membrane porose (macroarray). Ci possono essere ovunque da 100 spot a più di 10.000 su un dato array. Gli array possono anche essere realizzati con molecole diverse dal DNA.

Oligonucleotide allele-specifico

L'oligonucleotide allele-specifico (ASO) è una tecnica che consente il rilevamento di singole mutazioni di base senza la necessità di PCR o elettroforesi su gel. Le sonde marcate corte (20-25 nucleotidi di lunghezza) sono esposte al DNA bersaglio non frammentato, l'ibridazione avviene con un'elevata specificità a causa della breve lunghezza delle sonde e anche un singolo cambio di base ostacolerà l'ibridazione. Il DNA bersaglio viene quindi lavato e le sonde etichettate che non si sono ibridate vengono rimosse. Il DNA bersaglio viene quindi analizzato per la presenza della sonda tramite radioattività o fluorescenza. In questo esperimento, come nella maggior parte delle tecniche di biologia molecolare, è necessario utilizzare un controllo per garantire il successo della sperimentazione.

Nella biologia molecolare, le procedure e le tecnologie vengono continuamente sviluppate e le vecchie tecnologie abbandonate. Ad esempio, prima dell'avvento dell'elettroforesi su gel del DNA ( agarosio o poliacrilammide ), la dimensione delle molecole di DNA era tipicamente determinata dalla velocità di sedimentazione in gradienti di saccarosio, una tecnica lenta e laboriosa che richiedeva una strumentazione costosa; prima dei gradienti di saccarosio, è stata utilizzata la viscosimetria . A parte il loro interesse storico, spesso vale la pena conoscere la tecnologia più vecchia, poiché occasionalmente è utile per risolvere un altro nuovo problema per il quale la tecnica più recente è inappropriata.

Guarda anche

Riferimenti

Ulteriori letture

link esterno