Bakteriologisk vannanalyse - Bacteriological water analysis
Bakteriologisk vannanalyse er en metode for å analysere vann for å estimere antall tilstedeværende bakterier og, om nødvendig, for å finne ut hva slags bakterier de er. Det representerer ett aspekt av vannkvaliteten . Det er en mikrobiologisk analytisk prosedyre som bruker vannprøver og som bestemmer konsentrasjonen av bakterier fra disse prøvene. Det er da mulig å trekke slutninger om vannets egnethet for bruk fra disse konsentrasjonene. Denne prosessen brukes for eksempel for å rutinemessig bekrefte at vann er trygt for konsum eller at bading og rekreasjonsvann er trygt å bruke.
Tolkningen og handlingsutløsernivået for forskjellige vann varierer avhengig av bruken av vannet. Mens svært strenge nivåer gjelder drikkevann , gjelder mer avslappede nivåer for marine badevann, der det forventes at mye lavere vannmengder blir inntatt av brukerne.
Nærme seg
Felles for alle disse rutinemessige screeningprosedyrene er at den primære analysen er for indikatororganismer i stedet for patogener som kan forårsake bekymring. Indikatororganismer er bakterier som ikke-spesifikke coliforme , Escherichia coli og Pseudomonas aeruginosa som er veldig ofte funnet i tarmene hos mennesker eller dyr, og som, hvis det oppdages, kan tyde på tilstedeværelse av kloakk . Indikatororganismer brukes fordi selv når en person er smittet med mer patogene bakterier, vil de fremdeles skilles ut mange millioner ganger flere indikatororganismer enn patogener. Det er derfor rimelig å anta at hvis nivåer av indikatororganisme er lave, vil patogennivåene være veldig mye lavere eller fraværende. Vurderinger om vannets brukbarhet er basert på svært omfattende presedenser og er knyttet til sannsynligheten for at en hvilken som helst prøvepopulasjon av bakterier kan være smittsom på et rimelig statistisk nivå av tillit.
Analyse utføres vanligvis ved bruk av kultur, biokjemiske og noen ganger optiske metoder. Når nivåer av indikatororganismer overstiger forhåndsinnstilte triggere, kan spesifikk analyse for patogener gjennomføres, og disse kan raskt oppdages (hvis det mistenkes) ved hjelp av spesifikke kulturmetoder eller molekylærbiologi .
Metoder
De mest pålitelige metodene er metoden for direkte platetelling og membranfiltreringsmetoden. mEndo Agar brukes i membranfiltrering mens VRBA Agar brukes i metoden for direkte platetelling. VRBA står for fiolett rød gallaagar. Et medium som inneholder gallsalt som fremmer veksten av gramnegativt og har hemmende karakteristikk til grampositivt, men ikke fullstendig hemmende.
Disse mediene inneholder laktose som vanligvis gjæres av laktose-gjærende bakterier som produserer kolonier som kan identifiseres og karakteriseres. Laktosefermentering produserer fargede kolonier, mens ikke-laktosefermentering produserer fargeløse. Fordi analysen alltid er basert på en veldig liten prøve tatt fra et veldig stort vannvolum, er alle metodene avhengige av statistiske prinsipper.
</ref>
Metode for flere rør
En av de eldste metodene kalles metoden med flere rør. I denne metoden fortynnes en målt underprøve (kanskje 10 ml) med 100 ml sterilt vekstmedium, og en mengde på 10 ml dekanteres deretter i hvert av de ti rør. De resterende 10 ml fortynnes deretter igjen og prosessen gjentas. På slutten av fem fortynninger gir dette 50 rør som dekker fortynningsområdet fra 1:10 til 1: 10000.
Rørene inkuberes deretter ved en forhåndsinnstilt temperatur i en spesifisert tid, og ved slutten av prosessen telles antall rør med innvekst for hver fortynning. Statistiske tabeller brukes deretter til å utlede konsentrasjonen av organismer i den opprinnelige prøven. Denne metoden kan forbedres ved å bruke indikatormedium som endrer farge når syredannende arter er til stede, og ved å inkludere et lite invertert rør kalt et Durham-rør i hvert prøverør. Invertert rør fra Durham fanger opp produsert gass. Produksjonen av gass ved 37 grader Celsius er en sterk indikasjon på tilstedeværelsen av Escherichia coli .
ATP-testing
En ATP-test er prosessen med raskt å måle aktive mikroorganismer i vann gjennom påvisning av adenosintrifosfat (ATP). ATP er et molekyl som bare finnes i og rundt levende celler, og som sådan gir det et direkte mål på biologisk konsentrasjon og helse. ATP kvantifiseres ved å måle lyset som produseres gjennom reaksjonen med det naturlig forekommende enzymet firefly luciferase ved hjelp av et luminometer . Mengden produsert lys er direkte proporsjonal med mengden biologisk energi som er tilstede i prøven.
Andre generasjons ATP-tester er spesielt designet for vann, avløpsvann og industrielle applikasjoner der for det meste prøver inneholder en rekke komponenter som kan forstyrre ATP-analysen.
Platetelling
Platetellingmetoden er avhengig av at bakterier dyrker en koloni på et næringsmedium, slik at kolonien blir synlig for det blotte øye, og antall kolonier på en plate kan telles. For å være effektiv, må fortynningen av den opprinnelige prøven ordnes slik at det i gjennomsnitt dyrkes mellom 30 og 300 kolonier av målbakterien. Færre enn 30 kolonier gjør tolkningen statistisk dårlig, mens mer enn 300 kolonier ofte resulterer i overlappende kolonier og upresisjon i tellingen. For å sikre at et passende antall kolonier vil bli generert, dyrkes vanligvis flere fortynninger. Denne tilnærmingen er mye brukt for evaluering av effektiviteten av vannbehandling ved inaktivering av representative mikrobielle forurensninger som E. coli etter ASTM D5465.
Laboratorieprosedyren innebærer å lage seriefortynninger av prøven (1:10, 1: 100, 1: 1000 osv.) I sterilt vann og dyrke disse på næringsagar i en tallerken som er forseglet og inkubert. Typiske medier inkluderer platetellingagar for en generell telling eller MacConkey-agar for å telle gramnegative bakterier som E. coli . Vanligvis inkuberes ett sett med plater ved 22 ° C og i 24 timer og et annet sett ved 37 ° C i 24 timer. Sammensetningen av næringsstoffet inkluderer vanligvis reagenser som motstår vekst av ikke-målorganismer og gjør målorganismen lett identifisert, ofte ved en fargeendring i mediet. Noen nylige metoder inkluderer et fluorescerende middel slik at telling av koloniene kan automatiseres. På slutten av inkubasjonsperioden telles koloniene med øye, en prosedyre som tar noen øyeblikk og ikke krever et mikroskop, ettersom koloniene vanligvis er noen få millimeter tvers.
Membranfiltrering
De fleste moderne laboratorier bruker en forbedring av det totale antall plater der seriefortynninger av prøven vakuumfiltreres gjennom spesialfremstilte membranfiltre, og disse filtrene blir selv lagt på næringsmedium i forseglede plater. Metodikken ligner ellers på konvensjonelle totale platetall. Membraner har et trykket millimeter rutenett trykt på og kan pålitelig brukes til å telle antall kolonier under et kikkertmikroskop.
Hell platemetoden
Når analysen leter etter bakteriearter som vokser dårlig i luft, gjøres den første analysen ved å blande seriefortynninger av prøven i flytende næringsagar som deretter helles i flasker som deretter forsegles og legges på sidene for å produsere en skrånende agar flate. Kolonier som utvikler seg i kroppens medium kan telles med øye etter inkubasjon.
Totalt antall kolonier er referert til som total levedyktig telling (TVC). Måleenheten er cfu / ml (eller kolonidannende enheter per milliliter) og gjelder den opprinnelige prøven. Beregning av dette er et multiplum av det tellede antall kolonier ganget med fortynningen som brukes.
Patogenanalyse
Når prøver viser forhøyede nivåer av indikatorbakterier, blir ytterligere analyse ofte foretatt for å lete etter spesifikke patogene bakterier. Arter som ofte undersøkes i den tempererte sonen inkluderer Salmonella typhi og Salmonella Typhimurium . Avhengig av sannsynlig kilde til forurensning kan også undersøkelser omfatte organismer som Cryptosporidium spp . I tropiske områder foretas også rutinemessig analyse av Vibrio cholerae .
Typer næringsmedier som brukes i analysen
MacConkey-agar er dyrkningsmedium designet for å dyrke gramnegative bakterier og flekker dem for laktosejæring. Den inneholder gallsalt (for å hemme de fleste gram-positive bakterier), krystallfiolett fargestoff (som også hemmer visse gram-positive bakterier), nøytralt rødt fargestoff (som flekker mikrober som gjærer laktose), laktose og pepton . Alfred Theodore MacConkey utviklet den mens han jobbet som bakteriolog for Royal Commission on Sloage Disposal i Storbritannia .
Endo agar inneholder pepton, laktose, dikaliumfosfat , agar, natriumsulfitt, basisk fuchsin og ble opprinnelig utviklet for isolering av Salmonella typhi , men brukes nå ofte i vannanalyse. Som i MacConkey-agar gjærer koliforme organismer laktosen, og koloniene blir røde. Ikke-laktose-gjærende organismer produserer klare, fargeløse kolonier mot den svake rosa bakgrunnen til mediet.
mFC-medium brukes i membranfiltrering og inneholder selektive og differensielle midler. Disse inkluderer rosolsyre for å hemme bakterievekst generelt, bortsett fra fecal coliforms, gallesalter hemmer ikke-enteriske bakterier og anilinblått indikerer evnen til fecal coliforms til å gjære laktose til syre som forårsaker en pH-endring i mediet.
TYEA-medium inneholder trypton , gjærekstrakt , vanlig salt og L-arabinose per liter glassdestillert vann og er et ikke-selektivt medium som vanligvis dyrkes ved to temperaturer (22 og 36 ° C) for å bestemme et generelt forurensningsnivå (aka kolonitelling) .