Analiza bacteriologică a apei - Bacteriological water analysis
Analiza bacteriologică a apei este o metodă de analiză a apei pentru a estima numărul de bacterii prezente și, dacă este necesar, pentru a afla ce fel de bacterii sunt. Reprezintă un aspect al calității apei . Este o procedură analitică microbiologică care folosește probe de apă și din aceste probe determină concentrația bacteriilor. Apoi este posibil să se tragă inferențe despre adecvarea apei pentru utilizare din aceste concentrații. Acest proces este utilizat, de exemplu, pentru a confirma în mod obișnuit că apa este sigură pentru consumul uman sau că apele de scăldat și recreative sunt sigure de utilizat.
Interpretarea și nivelurile declanșatoare ale acțiunii pentru diferite ape variază în funcție de utilizarea apei. În timp ce nivelurile foarte stricte se aplică apei potabile , niveluri mai relaxate se aplică apelor marine pentru scăldat, unde se așteaptă ca consumatorii să ingereze volume mult mai mici de apă.
Abordare
Caracteristica comună a tuturor acestor proceduri de screening de rutină este că analiza primară se referă mai degrabă la organismele indicatoare decât la agenții patogeni care ar putea cauza îngrijorare. Organismele indicatoare sunt bacterii precum coliformele nespecifice, Escherichia coli și Pseudomonas aeruginosa care se găsesc foarte frecvent în intestinul uman sau animal și care, dacă sunt detectate, pot sugera prezența apelor uzate . Organismele indicatoare sunt folosite, deoarece chiar și atunci când o persoană este infectată cu o bacterie mai patogenă, acestea vor excreta de multe ori mai multe milioane de organisme indicatoare decât agenții patogeni. Prin urmare, este rezonabil să presupunem că, dacă nivelurile organismului indicator sunt scăzute, atunci nivelurile de agenți patogeni vor fi mult mai mici sau absente. Judecățile cu privire la adecvarea apei pentru utilizare se bazează pe precedente foarte extinse și se referă la probabilitatea ca orice populație de eșantion de bacterii să poată fi infectă la un nivel statistic rezonabil de încredere.
Analiza se efectuează de obicei folosind metode de cultură, biochimice și uneori optice. Atunci când nivelurile organismelor indicatoare depășesc factorii declanșatori presetați, poate fi efectuată apoi o analiză specifică pentru agenții patogeni și aceștia pot fi detectați rapid (acolo unde sunt suspectați) utilizând metode specifice de cultură sau biologie moleculară .
Metodologii
Cele mai fiabile metode sunt metoda numărării directe a plăcilor și metoda filtrării cu membrană. Agar mEndo este utilizat în filtrarea cu membrană, în timp ce Agar VRBA este utilizat în metoda numărării directe a plăcilor. VRBA înseamnă agar biliar roșu violet. Un mediu care conține săruri biliare care promovează creșterea gram negativ și are o caracteristică inhibitoare la gram pozitivă, deși nu este complet inhibitoare.
Aceste medii conțin lactoză care este de obicei fermentată de bacterii care fermentează lactoza producând colonii care pot fi identificate și caracterizate. Fermentarea lactozei produce colonii colorate, în timp ce fermentarea fără lactoză produce incolore. Deoarece analiza se bazează întotdeauna pe un eșantion foarte mic prelevat dintr-un volum foarte mare de apă, toate metodele se bazează pe principii statistice.
</ref>
Metoda cu tuburi multiple
Una dintre cele mai vechi metode se numește metoda cu tuburi multiple. În această metodă, o sub-probă măsurată (poate 10 ml) este diluată cu 100 ml mediu de creștere steril și o alicotă de 10 ml este apoi decantată în fiecare dintre cele zece tuburi. Restul de 10 ml sunt apoi diluați din nou și procesul se repetă. La sfârșitul a 5 diluții, aceasta produce 50 de tuburi care acoperă intervalul de diluare de la 1:10 până la 1: 10000.
Tuburile sunt apoi incubate la o temperatură prestabilită pentru un timp specificat și la sfârșitul procesului, numărul de tuburi cu creștere este numărat pentru fiecare diluare. Tabelele statistice sunt apoi utilizate pentru a obține concentrația de organisme din eșantionul original. Această metodă poate fi îmbunătățită prin utilizarea unui mediu indicator care schimbă culoarea atunci când sunt prezente specii care formează acid și prin includerea unui tub mic inversat numit tub Durham în fiecare tub eșantion. Tubul inversat Durham captează orice gaz produs. Producția de gaz la 37 de grade Celsius este un indiciu puternic al prezenței Escherichia coli .
Testarea ATP
Un test ATP este procesul de măsurare rapidă a microorganismelor active din apă prin detectarea adenozin trifosfatului (ATP). ATP este o moleculă care se găsește numai în și în jurul celulelor vii și, ca atare, oferă o măsură directă a concentrației biologice și a sănătății. ATP este cuantificat prin măsurarea luminii produse prin reacția sa cu enzima naturală luciferază licurică folosind un luminometru . Cantitatea de lumină produsă este direct proporțională cu cantitatea de energie biologică prezentă în probă.
Testele ATP de a doua generație sunt special concepute pentru apă, ape uzate și aplicații industriale în care, în cea mai mare parte, probele conțin o varietate de componente care pot interfera cu testul ATP.
Numărul de plăci
Metoda numărării plăcilor se bazează pe bacteriile care cresc o colonie pe un mediu nutritiv, astfel încât colonia să devină vizibilă cu ochiul liber și numărul de colonii pe o placă poate fi numărat. Pentru a fi eficientă, diluarea eșantionului original trebuie să fie aranjată astfel încât să crească în medie între 30 și 300 de colonii ale bacteriei țintă. Mai puțin de 30 de colonii fac ca interpretarea să fie nesatisfăcătoare din punct de vedere statistic, în timp ce mai mult de 300 de colonii duc adesea la suprapunerea coloniilor și la imprecizie în număr. Pentru a se asigura că se va genera un număr adecvat de colonii, se cultivă în mod normal mai multe diluții. Această abordare este utilizată pe scară largă pentru evaluarea eficienței tratamentului apei prin inactivarea contaminanților microbieni reprezentativi, cum ar fi E. coli, după ASTM D5465.
Procedura de laborator presupune efectuarea de diluții seriale ale probei (1:10, 1: 100, 1: 1000 etc.) în apă sterilă și cultivarea acestora pe agar nutritiv într-un vas sigilat și incubat. Mediile tipice includ agar de numărare a plăcilor pentru un număr general sau agar MacConkey pentru numărarea bacteriilor Gram-negative, cum ar fi E. coli . De obicei, un set de plăci este incubat la 22 ° C și timp de 24 de ore și un al doilea set la 37 ° C timp de 24 de ore. Compoziția nutrientului include de obicei reactivi care rezistă la creșterea organismelor nețintă și fac ca organismul țintă să fie ușor identificat, adesea printr-o schimbare de culoare a mediului. Unele metode recente includ un agent fluorescent, astfel încât numărarea coloniilor să poată fi automatizată. La sfârșitul perioadei de incubație, coloniile sunt numărate cu ochiul, o procedură care durează câteva momente și nu necesită microscop, deoarece coloniile au de obicei câțiva milimetri lățime.
Filtrarea cu membrană
Majoritatea laboratoarelor moderne utilizează un rafinament al numărului total de plăci, în care diluțiile seriale ale probei sunt filtrate sub vid prin filtrele de membrană special create , iar aceste filtre sunt ele însele așezate pe mediu nutritiv în plăci sigilate. Metodologia este altfel similară cu numărul total convențional de plăci. Membranele au imprimată o grilă milimetrică tipărită și pot fi utilizate în mod fiabil pentru a număra numărul de colonii la microscop binocular.
Se toarnă metoda plăcii
Când analiza caută specii bacteriene care cresc slab în aer, analiza inițială se face prin amestecarea diluțiilor seriale ale probei în agar lichid nutritiv care este apoi turnat în sticle care sunt apoi sigilate și așezate pe părțile lor pentru a produce un agar înclinat suprafaţă. Coloniile care se dezvoltă în corpul mediului pot fi numărate prin ochi după incubare.
Numărul total de colonii este denumit număr total viabil (TVC). Unitatea de măsură este cfu / ml (sau unități care formează colonii pe mililitru) și se referă la proba originală. Calculul acestuia este un multiplu al numărului numărat de colonii înmulțit cu diluția utilizată.
Analiza agentului patogen
Când eșantioanele prezintă niveluri ridicate de bacterii indicator, se efectuează adesea analize suplimentare pentru a căuta bacterii patogene specifice. Speciile frecvent cercetate în zona temperată includ Salmonella typhi și Salmonella Typhimurium . În funcție de sursa probabilă de investigare a contaminării, se poate extinde și asupra organismelor precum Cryptosporidium spp . În zonele tropicale, analiza Vibrio cholerae este de asemenea efectuată în mod obișnuit.
Tipuri de medii nutritive utilizate în analiză
Agar MacConkey este un mediu de cultură conceput pentru a crește bacterii Gram-negative și a le colora pentru fermentarea lactozei. Conține săruri biliare (pentru a inhiba majoritatea bacteriilor Gram-pozitive), colorant violet cristal (care inhibă și anumite bacterii Gram-pozitive), colorant roșu neutru (care colorează microbii care fermentează lactoza), lactoză și peptonă . Alfred Theodore MacConkey a dezvoltat-o în timp ce lucra ca bacteriolog la Comisia Regală pentru eliminarea apelor reziduale din Regatul Unit .
Agarul Endo conține peptonă, lactoză, fosfat dipotasic , agar, sulfit de sodiu, fucsină bazică și a fost dezvoltat inițial pentru izolarea Salmonella typhi , dar este acum utilizat în mod obișnuit în analiza apei. Ca și în agar-ul MacConkey, organismele coliforme fermentează lactoza, iar coloniile devin roșii. Organismele care nu fermentează lactoza produc colonii clare, incolore, pe fundalul slab roz al mediului.
Mediul mFC este utilizat în filtrarea cu membrană și conține agenți selectivi și diferențiali. Acestea includ acidul rosolic pentru a inhiba creșterea bacteriană în general, cu excepția coliformelor fecale, sărurile biliare inhibă bacteriile ne-enterice, iar albastrul de anilină indică capacitatea coliformelor fecale de a fermenta lactoza în acid care determină o schimbare a pH-ului în mediu.
Mediul TYEA conține triptonă , extract de drojdie , sare obișnuită și L-arabinoză pe litru de apă distilată din sticlă și este un mediu neselectiv cultivat de obicei la două temperaturi (22 și 36 ° C) pentru a determina un nivel general de contaminare (numit și numărul de colonii) .