Bakteriologisk vattenanalys - Bacteriological water analysis
Bakteriologisk vattenanalys är en metod för att analysera vatten för att uppskatta antalet närvarande bakterier och, om det behövs, för att ta reda på vilken typ av bakterier de är. Det representerar en aspekt av vattenkvaliteten . Det är ett mikrobiologiskt analytiskt förfarande som använder vattenprover och bestämmer koncentrationen av bakterier från dessa prover. Det är då möjligt att dra slutsatser om vattnets lämplighet för användning från dessa koncentrationer. Denna process används till exempel för att rutinmässigt bekräfta att vatten är säkert att konsumera eller att bad- och fritidsvatten är säkert att använda.
Tolkningen och åtgärdsutlösarnivåerna för olika vatten varierar beroende på användningen av vattnet. Medan mycket stränga nivåer gäller för dricksvatten , gäller mer avslappnade nivåer för marina badvatten, där mycket lägre vattenmängder förväntas tas av användarna.
Närma sig
Det gemensamma särdraget med alla dessa rutinmässiga screeningprocedurer är att den primära analysen är för indikatororganismer snarare än patogener som kan orsaka oro. Indikatororganismer är bakterier såsom ospecifika koliformer , Escherichia coli och Pseudomonas aeruginosa som mycket vanligt förekommer i människors eller djurtarmen och som, om det upptäcks, kan föreslå förekomst av avloppsvatten . Indikatororganismer används för att även när en person är infekterad med mer patogena bakterier kommer de fortfarande att utsöndras många miljoner gånger mer indikatororganismer än patogener. Det är därför rimligt att anta att om indikatororganismnivåerna är låga så kommer patogennivåerna att vara mycket lägre eller frånvarande. Bedömningar av vattenets lämplighet för användning baseras på mycket omfattande prejudikat och avser sannolikheten för att en provpopulation av bakterier kan vara smittsam vid en rimlig statistisk konfidensnivå.
Analys utförs vanligtvis med odling, biokemiska och ibland optiska metoder. När indikatororganismerna överstiger förinställda utlösare kan specifik analys för patogener genomföras och dessa kan snabbt upptäckas (om det misstänks) med hjälp av specifika odlingsmetoder eller molekylärbiologi .
Metoder
De mest tillförlitliga metoderna är metoden för direktplatträkning och membranfiltreringsmetod. mEndo Agar används vid membranfiltrering medan VRBA Agar används i metoden för direkt räkning av plattor. VRBA står för violett röd gallaagar. Ett medium som innehåller gallsalter som främjar tillväxten av gramnegativt och har hämmande egenskaper till grampositiva men inte fullständigt hämmande.
Dessa medier innehåller laktos som vanligtvis fermenteras av laktosjäsande bakterier som producerar kolonier som kan identifieras och karakteriseras. Laktosjäsning producerar färgade kolonier medan icke laktosjäsning ger färglösa. Eftersom analysen alltid baseras på ett mycket litet prov som tas från en mycket stor vattenvolym, är alla metoder beroende av statistiska principer.
</ref>
Metod för flera rör
En av de äldsta metoderna kallas metoden för flera rör. I denna metod späds ett uppmätt delprov (kanske 10 ml) med 100 ml sterilt tillväxtmedium och en alikvot på 10 ml dekanteras sedan i vart och ett av tio rör. De återstående 10 ml späds sedan ut igen och processen upprepas. I slutet av 5 utspädningar produceras 50 rör som täcker utspädningsområdet 1:10 till 1: 10000.
Rören inkuberas sedan vid en förinställd temperatur under en specificerad tid och i slutet av processen räknas antalet rör med tillväxt in för varje utspädning. Statistiska tabeller används sedan för att härleda organismernas koncentration i det ursprungliga provet. Denna metod kan förbättras genom att använda indikatormedium som ändrar färg när syrabildande arter är närvarande och genom att inkludera ett litet inverterat rör som kallas ett Durham-rör i varje provrör. Det inverterade röret i Durham fångar upp gas som produceras. Produktionen av gas vid 37 grader Celsius är en stark indikation på förekomsten av Escherichia coli .
ATP-testning
Ett ATP-test är processen för att snabbt mäta aktiva mikroorganismer i vatten genom detektering av adenosintrifosfat (ATP). ATP är en molekyl som endast finns i och runt levande celler, och som sådan ger den ett direkt mått på biologisk koncentration och hälsa. ATP kvantifieras genom att mäta ljuset som produceras genom dess reaktion med det naturligt förekommande enzymet eldflugeluciferas med hjälp av en luminometer . Mängden producerat ljus är direkt proportionell mot mängden biologisk energi som finns i provet.
Andra generationens ATP-tester är specifikt utformade för vatten, avloppsvatten och industriella applikationer där för det mesta prover innehåller en mängd olika komponenter som kan störa ATP-analysen.
Tallrik
Plåträkningsmetoden är beroende av bakterier som odlar en koloni på ett näringsmedium så att kolonin blir synlig för blotta ögat och antalet kolonier på en platta kan räknas. För att vara effektiv måste utspädningen av det ursprungliga provet ordnas så att i genomsnitt mellan 30 och 300 kolonier av målbakterien odlas. Färre än 30 kolonier gör tolkningen statistiskt osund medan mer än 300 kolonier ofta resulterar i överlappande kolonier och oprecision i räkningen. För att säkerställa att ett lämpligt antal kolonier genereras, odlas normalt flera utspädningar. Detta tillvägagångssätt används i stor utsträckning för utvärdering av vattenbehandlingseffektiviteten genom inaktivering av representativa mikrobiella föroreningar såsom E. coli efter ASTM D5465.
Laborationsproceduren innefattar att göra serieutspädningar av provet (1:10, 1: 100, 1: 1000, etc.) i sterilt vatten och odla dessa på näringsagar i en skål som förseglas och inkuberas. Typiska media inkluderar plåträknagar för ett allmänt antal eller MacConkey-agar för att räkna gramnegativa bakterier såsom E. coli . Vanligtvis inkuberas en uppsättning plattor vid 22 ° C och under 24 timmar och en andra uppsättning vid 37 ° C under 24 timmar. Sammansättningen av näringsämnet innehåller vanligtvis reagens som motstår tillväxten av icke-målorganismer och gör målorganismen lätt identifierbar, ofta genom en färgförändring i mediet. Några nya metoder inkluderar ett fluorescerande medel så att räkningen av kolonierna kan automatiseras. I slutet av inkubationsperioden räknas kolonierna med ögat, ett förfarande som tar några ögonblick och inte kräver ett mikroskop eftersom kolonierna vanligtvis är några millimeter breda.
Membranfiltrering
De flesta moderna laboratorier använder en förfining av det totala antalet plattor där serieutspädningar av provet vakuumfiltreras genom specialgjorda membranfilter och dessa filter läggs själva på näringsmedium i förseglade plattor. Metoden liknar annars konventionella totala plattantal. Membran har ett tryckt millimeter rutnät tryckt på och kan på ett tillförlitligt sätt räknas antalet kolonier under ett kikarmikroskop.
Häll plattmetoden
När analysen letar efter bakteriearter som växer dåligt i luft görs den första analysen genom att blanda seriella utspädningar av provet i flytande näringsagar som sedan hälls i flaskor som sedan förseglas och läggs på deras sidor för att producera en sluttande agar yta. Kolonier som utvecklas i kroppens medium kan räknas med ögat efter inkubation.
Det totala antalet kolonier kallas det totala livskraftiga antalet (TVC). Måttenheten är cfu / ml (eller kolonibildande enheter per milliliter) och avser det ursprungliga provet. Beräkning av detta är en multipel av det räknade antalet kolonier multiplicerat med den använda utspädningen.
Patogenanalys
När prover visar förhöjda nivåer av indikatorbakterier utförs vidare analys för att leta efter specifika patogena bakterier. Arter som ofta undersöks i den tempererade zonen inkluderar Salmonella typhi och Salmonella Typhimurium . Beroende på den troliga källan till kontaminering kan undersökningen även omfatta organismer som Cryptosporidium spp . I tropiska områden genomförs också rutinmässigt analys av Vibrio cholerae .
Typer av näringsmedier som används i analysen
MacConkey-agar är odlingsmedium utformat för att odla gramnegativa bakterier och fläcka dem för laktosjäsning. Den innehåller gallsalter (för att hämma de flesta gram-positiva bakterier), kristallviolett färgämne (som också hämmar vissa gram-positiva bakterier), neutralt rött färgämne (som fläckar mikrober som jäser laktos), laktos och pepton . Alfred Theodore MacConkey utvecklade den medan han arbetade som bakteriolog för Royal Commission on Clowage Disposal i Storbritannien .
Endo-agar innehåller pepton, laktos, dikaliumfosfat , agar, natriumsulfit, basiskt fuchsin och utvecklades ursprungligen för isolering av Salmonella typhi , men används nu ofta i vattenanalys. Som i MacConkey-agar, jäser koliforma organismer laktosen och kolonierna blir röda. Icke-laktosjäsande organismer producerar klara, färglösa kolonier mot den svaga rosa bakgrunden hos mediet.
mFC-medium används vid membranfiltrering och innehåller selektiva och differentiella medel. Dessa inkluderar rosolsyra för att hämma bakterietillväxt i allmänhet, med undantag för fekal coliformer, gallsalter hämmar icke-enteriska bakterier och anilinblått indikerar förmågan hos fekal coliformer att jäsa laktos till syra som orsakar en pH-förändring i mediet.
TYEA-medium innehåller trypton , jästextrakt , vanligt salt och L-arabinos per liter glasdestillerat vatten och är ett icke-selektivt medium som vanligtvis odlas vid två temperaturer (22 och 36 ° C) för att bestämma en allmän föroreningsnivå (aka koloninantal) .