Firefly luciferas - Firefly luciferase
| Firefly luciferas | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
 Struktur av Photinus pyralis eldfluga luciferas.
| |||||||
| Identifierare | |||||||
| Organism | |||||||
| Symbol | Ej tillämpligt | ||||||
| FBF | 1LCI | ||||||
| UniProt | P08659 | ||||||
| |||||||
| Firefly luciferas | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Identifierare | |||||||||
| EG-nr | 1.13.12.7 | ||||||||
| Databaser | |||||||||
| IntEnz | IntEnz-vy | ||||||||
| BRENDA | BRENDA-post | ||||||||
| EXPASy | Utsikt över NiceZyme | ||||||||
| KEGG | KEGG-post | ||||||||
| MetaCyc | Metabolisk väg | ||||||||
| PRIAM | profil | ||||||||
| FBF- strukturer | RCSB PDB PDBe PDBsum | ||||||||
| Genontologi | AmiGO / QuickGO | ||||||||
| |||||||||
Firefly luciferas är det ljusemitterande enzymet som ansvarar för bioluminescensen hos eldflugor och klickbaggar . Enzymet katalyserar oxidationen av eldflugeluciferin, vilket kräver syre och ATP . På grund av kravet på ATP har eldflugeluciferaser använts i stor utsträckning inom bioteknik.
Reaktionsmekanism
Den kemiska reaktionen katalyserad av eldflugeluciferas sker i två steg:
- luciferin + ATP → luciferyladenylat + PP i
- luciferyl adenylate + O 2 → oxyluciferin + AMP + ljus
Ljus produceras eftersom reaktionen bildar oxyluciferin i ett elektroniskt exciterat tillstånd . Reaktionen frigör en ljusfoton när oxyluciferin går tillbaka till marktillståndet .
Luciferyl adenylat kan dessutom delta i en sidoreaktion med O 2 för att bilda väteperoxid och dehydroluciferyl-AMP. Cirka 20% av luciferyladenylatmellanprodukten oxideras i denna väg.
Firefly-luciferas genererar ljus från luciferin i en flerstegsprocess. Först, är D-luciferin adenylerad av MgATP att bilda luciferyl adenylat och pyrofosfat. Efter aktivering med ATP oxideras luciferyladenylat med molekylärt syre för att bilda en dioxetanonring. En dekarboxyleringsreaktion bildar ett exciterat tillstånd av oxyluciferin, som tautomeriseras mellan keto-enolformen. Reaktionen avger äntligen ljus när oxyluciferin återgår till marktillståndet.
Bifunktionalitet
Luciferas kan fungera i två olika vägar: en bioluminescensväg och en CoA- ligasväg. I båda vägarna katalyserar luciferas initialt en adenyleringsreaktion med MgATP. Men i CoA-ligasvägen kan CoA förskjuta AMP för att bilda luciferyl CoA .
Fet acyl-CoA-syntetas aktiverar på liknande sätt fettsyror med ATP, följt av förskjutning av AMP med CoA. På grund av deras liknande aktiviteter kan luciferas ersätta fettacyl-CoA-syntetas och omvandla långkedjiga fettsyror till fettacyl CoA för beta-oxidation .
Strukturera
Proteinstrukturen hos eldflugeluciferas består av två kompakta domäner : den N-terminala domänen och den C-terminala domänen. Den N-terminala domänen består av två β-ark i en αβαβα-struktur och en β-fat . De två β-arken staplas ovanpå varandra, med β-tunnan som täcker änden av arken.
C-terminaldomänen är ansluten till N-terminaldomänen med ett flexibelt gångjärn som kan separera de två domänerna. De aminosyrasekvenser på ytan av de två domänerna mot varandra vända är konserverade i bakteriell och eldflugeluciferas och därigenom starkt antyder att aktiva sätet är beläget i klyftan mellan domänerna.
Under en reaktion har luciferas en konformationsförändring och går in i en "sluten" form med de två domänerna som kommer ihop för att stänga substratet. Detta säkerställer att vatten utesluts från reaktionen och inte hydrolyserar ATP eller den elektroniskt exciterade produkten.
Spektrala skillnader i bioluminescens
Fireflu luciferas bioluminescensfärg kan variera mellan gulgrön (λ max = 550 nm) till röd (λ max = 620). Finns det för närvarande flera olika mekanismer som beskriver hur strukturen av luciferas påverkar emissionsspektrum av fotonen och effektivt färgen på det ljus som avges.
En mekanism föreslår att färgen på det emitterade ljuset beror på om produkten är i keto- eller enolform . Mekanismen antyder att rött ljus avges från ketoformen av oxyluciferin, medan grönt ljus avges från enolformen av oxyluciferin. Emellertid avger 5,5-dimetyloxyluciferin grönt ljus trots att det är begränsat till ketoformen eftersom det inte kan tautomerisera.
En annan mekanism föreslår att vridning av vinkeln mellan bensotiazol och tiazolringar i oxyluciferin bestämmer färgen på bioluminescens. Denna förklaring föreslår att en plan form med en vinkel på 0 ° mellan de två ringarna motsvarar ett högre energitillstånd och avger ett grönt ljus med högre energi, medan en vinkel på 90 ° sätter strukturen i ett lägre energitillstånd och avger ett lägre -energirött ljus.
Den senaste förklaringen till bioluminescensfärgen undersöker mikromiljön hos det exciterade oxyluciferinet. Studier tyder på att interaktionerna mellan den exciterade tillståndsprodukten och närliggande rester kan tvinga oxyluciferinet till en ännu högre energiform, vilket resulterar i utsläpp av grönt ljus. Exempelvis har Arg 218 elektrostatiska interaktioner med andra närliggande rester, vilket begränsar oxyluciferin från att tautomeriseras till enolformen. På liknande sätt har andra resultat visat att mikromiljön hos luciferas kan tvinga oxyluciferin till en mer stel, högenergistruktur och tvinga den att avge ett grönt ljus med hög energi.
Förordning
D-luciferin är substratet för eldflugeluciferas bioluminescensreaktion, medan L-luciferin är substratet för luciferyl-CoA-syntasaktivitet. Båda reaktionerna hämmas av substratets enantiomer: L-luciferin och D-luciferin hämmar bioluminescensvägen respektive CoA-ligasvägen. Detta visar att luciferas kan skilja mellan isomererna av luciferinstrukturen.
L-luciferin kan avge ett svagt ljus trots att det är en konkurrerande hämmare av D-luciferin och bioluminescensvägen. Ljus emitteras eftersom CoA-syntesvägen kan omvandlas till bioluminescensreaktionen genom att hydrolysera slutprodukten via ett esteras tillbaka till D-luciferin.
Luciferasaktivitet inhiberas dessutom av oxyluciferin och aktiveras allosteriskt av ATP. När ATP binder till enzymets två allosteriska platser ökar luciferasas affinitet för att binda ATP i dess aktiva ställe.